超聲均質法制備以乳清蛋白-OSA變性淀粉為乳化劑的納米乳液

楊貴妃，楊柳，鐘金鋒，覃小麗

(西南大學 食品科學學院，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶，400715)

目前，在食品領域，水包油型納米乳液主要用于包埋脂溶性功能物質，構建功能成分運輸載體，解決某些脂溶性功能物質水溶性差、生物利用率低等問題[1]。在納米乳液的制備過程中，常添加一些兩親性物質，使其吸附在油/水界面，通過靜電排斥或空間位阻效應維持納米乳液的穩定性[2]。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白組成，具有營養價值高、易于消化吸收等特點[3]，是制備納米乳液常用的乳化劑之一。但以乳清蛋白為單一類型乳化劑制備的納米乳液，在蛋白質等電點(pI ≈ 4.5)容易發生聚沉和絮凝，容易受到離子等條件的影響[4]，限制其在食品加工中的廣泛應用。因此，在以蛋白質為乳化劑的乳液中常添加一些多糖物質，利用多糖的空間位阻效應和黏度增加乳液的穩定性[5]。

目前，蛋白質乳液中常添加的多糖有果膠[6-7]、黃原膠[7-8]和大豆多糖[9]等。NEIRYNCK等[6]制備了pH=5.5的β-乳球蛋白乳液，發現在相同條件下β-乳球蛋白-果膠乳液更加穩定。因為果膠吸附在液滴界面引起靜電排斥作用增加，使乳液粒徑減小，并且通過顯微鏡觀察到乳液絮凝現象減少。QIU等[7]研究發現，與小麥蛋白乳液相比，在pH=3.5或5下小麥蛋白-黃原膠乳液能有效減少液滴在小麥蛋白等電點(pI=5)附近的聚集，明顯改善了該乳液在0.1 mol/L NaCl和0.02 mol/L CaCl2下的穩定性，并且在儲存4周內未觀察到相分離現象。辛烯基琥珀酸酯淀粉(octenyl succinic anhydride modified starch，OSA變性淀粉)是一種被FDA和GRAS認證的安全多糖，在食品中常作為乳化劑、穩定劑、增稠劑等，具有可降解、來源廣泛、廉價易獲取[10]等特點。TESCH等[11]發現OSA變性淀粉主要利用其多分支結構形成的空間位阻穩定液滴，其粒徑大小不受pH和離子價的影響，OSA變性淀粉在蛋白質等電點附近作為乳化劑具有明顯優勢。然而，OSA變性淀粉與蛋白質組合用于納米乳液制備的研究報道有限，添加OSA變性淀粉對蛋白質乳液穩定性的影響尚不清楚。

因此，擬以乳清蛋白-OSA變性淀粉組合制備納米乳液，探究乳清蛋白與OSA變性淀粉質量比和質量分數、超聲時間和功率等對納米乳液形成與穩定的影響；此外，研究不同環境因素(pH、Na+、Ca2+、溫度)下，添加OSA變性淀粉對乳清蛋白納米乳液穩定性的影響，為乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液在食品領域的應用提供一定借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白(CAS#9006-59-1，純度為80%)，合肥博美生物科技有限責任公司；辛烯基琥珀酸酯淀粉(HI-CAP100)，阿澤雷斯國際貿易(上海)有限公司；大豆油，益海嘉里食品營銷有限公司；超純水，YSL-RO-T10L/H超純水系統(Ashland公司)制備。

1.2 儀器與設備

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；T18 ULTRA-TURRAX型高速均質機，德國IKA公司；JY98-IIIDN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer NS90型激光粒徑儀，英國Malvern公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 納米乳液的制備方法

將一定質量的乳清蛋白溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=7)中，水浴攪拌2 h(30 ℃，500 r/min)后，滴加疊氮化鈉(使最終質量分數為0.02%)以抑制微生物的生長，將乳清蛋白溶液于4 ℃靜置11 h，使乳清蛋白充分溶脹。稱取一定質量OSA變性淀粉溶于乳清蛋白溶液中，水浴攪拌40 min(30 ℃，500 r/min)，得到水相。使用恒壓漏斗向水浴攪拌(30 ℃，500 r/min)的大豆油中滴加水相，滴加完后攪拌10 min。對上述得到的油水混合物進行均質(20 000 r/min，3 min)、超聲處理(通過冰水浴控制溫度不超過45 ℃)，得到納米乳液。

1.3.2 單因素試驗

按照1.3.1的方法制備納米乳液，以納米乳液的粒徑、多分散系數(polydispersity index，PDI)和外觀變化現象為評價指標，優化乳清蛋白與OSA變性淀粉質量比(0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0)、乳化劑質量分數(1%～9%)、油相質量分數(1%～7%)、超聲時間(3～28 min)和超聲功率(120～600 W)這5個影響納米乳液制備的主要因素。

1.3.3 穩定性試驗

根據單因素試驗優化條件(乳清蛋白-OSA變性淀粉質量比3∶7、乳化劑質量分數5%、油相質量分數1%、超聲時間23 min和超聲功率360 W)制備納米乳液備用，同時制備乳清蛋白納米乳液(乳清蛋白-OSA變性淀粉質量比10∶0、乳化劑質量分數5%、油相質量分數1%、超聲時間23 min和超聲功率360 W) 作對比，考察環境因素對乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液穩定性的影響。

不同環境因素的控制：用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調節納米乳液的pH(3～9)；用5 mol/L的NaCl溶液調節納米乳液中的鈉離子濃度(0～1.0 mol/L)；用3 mol/L的CaCl2溶液調節納米乳液中的鈣離子濃度(0～0.032 mol/L)；將納米乳液置于不同溫度(40～90 ℃)的水浴中保溫20 min，迅速冷卻至室溫。定期取樣測定各組納米乳液的粒徑，并觀察外觀變化。

1.4 粒徑和PDI的測定

為了盡量降低多重光散射效應，用超純水將待測納米乳液稀釋1 000倍，使用Zetasizer NS90型激光粒徑儀測定納米乳液的粒徑和PDI。測定溫度為25 ℃， 平衡時間為120 s，每個樣品平行測定2組，每組測定3次，每次測定值為13個子測試結果的平均值。

1.5 數據處理

每組試驗至少重復2次，每個樣品的各指標至少平行測定3次，結果以平均值±標準偏差表示。使用SPSS 18.0軟件對數據進行單因素方差分析(P<0.05時判斷組間存在顯著差異)，用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液的制備

2.1.1 乳清蛋白與OSA變性淀粉質量比對納米乳液的形成和穩定的影響

本環節固定乳化劑總質量分數為7%，油相質量分數為4%，超聲時間8 min，超聲功率360 W，考察乳清蛋白與OSA變性淀粉的質量比對納米乳液穩定性的影響。乳清蛋白與OSA變性淀粉質量比從10∶0變化到3∶7的過程中，納米乳液的粒徑顯著增加(P<0.05)了70.27 nm(圖1)，說明在乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液中，隨著蛋白質比例的減小，納米乳液的粒徑不斷增大。質量比為3∶7的納米乳液的粒徑和PDI均達到最大，分別為303 nm和0.23(圖1)，這可能是因為此時納米乳液的pH接近乳清蛋白等電點(表1)，乳清蛋白溶解度降低，乳化能力減弱，從而使納米乳液的穩定性降低。

圖1 乳清蛋白-OSA變性淀粉質量比對納米乳液的形成和穩定的影響Fig.1 Effect of whey protein-OSA modified starch weight ratio on the formation and stabilization of nanoemulsions

質量比從3∶7變化到0∶10，納米乳液的粒徑顯著減小(P<0.05)了61.97 nm，說明單獨使用OSA變性淀粉能形成粒徑較小的納米乳液。在乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液中，質量比為7∶3的納米乳液粒徑最小(244 nm)，并且在測定時間內，乳液粒徑基本不變。為進一步研究其他因素對乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液穩定性的影響，選取乳清蛋白-OSA變性淀粉質量比為7∶3。

表1 不同乳清蛋白-OSA變性淀粉質量比 下水相和納米乳液的pHTable 1 The pH of aqueous phase and nanoemulsions in different whey protein-OSA modified starch weight ratios

2.1.2 乳化劑質量分數對納米乳液的形成和穩定的影響

本環節固定乳清蛋白與OSA變性淀粉質量比為7∶3，油相質量分數為4%，超聲時間8 min，超聲功率360 W，考察乳化劑質量分數對納米乳液穩定性的影響。隨著乳化劑質量分數從1%增加到5%，納米乳液的粒徑從310 nm減小到255 nm，PDI從0.32減小到0.19；乳化劑質量分數大于5%時，納米乳液的粒徑和PDI分別維持在250 nm和0.16左右，乳化劑質量分數對粒徑和PDI變化無顯著(P>0.05)影響(圖2)。

圖2 乳化劑質量分數對納米乳液的形成和穩定的影響Fig.2 Effect of the mass fractin of the emulsifier on the formation and stabilization of nanoemulsions

這些結果表明，用于形成乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液的乳化劑存在臨界濃度。當乳化劑質量分數小于5%時，納米乳液表面在52 h出現白色薄層絮狀物，這可能是因為納米乳液液滴界面未被乳化劑飽和，從而發生了液滴的絮凝[12]。在5%的乳化劑質量分數下，納米乳液粒徑較小，分布比較均一。因此，5%的乳化劑制備的納米乳液具有較好的穩定性，此時納米乳液中液滴周圍的界面膜可能基本被乳化劑所覆蓋[13]。乳化劑質量分數大于5%時，納米乳液粒徑呈減小趨勢，但變化不顯著。因此選取乳化劑質量分數為5%。

2.1.3 油相質量分數對納米乳液的形成和穩定的影響

本環節固定乳清蛋白與OSA變性淀粉質量比為7∶3，乳化劑質量分數為5%，超聲時間8 min，超聲功率360 W，考察油相質量分數對納米乳液穩定性的影響。隨著油相質量分數從1%增加到7%，納米乳液的粒徑和PDI分別顯著(P<0.05)增加了89 nm和0.05(圖3)。

圖3 油相質量分數對納米乳液的形成和穩定的影響Fig.3 Effect of the mass fraction of oil phase on the formation and stabilization of nanoemulsions

在所研究的范圍內，油相質量濃度為7%的納米乳液粒徑和PDI最大，并且在27 h時，納米乳液表面產生白色薄層絮狀物。這可能是因為此時乳化劑不足以在大量的油滴表面形成致密的吸附層，反而可能充當油滴之間的橋梁從而導致液滴絮凝[14-15]。此外，隨著油相質量分數的增加，油滴之間碰撞的頻率可能不斷提高，使乳液液滴更易發生絮凝。當油相質量分數為1%時，納米乳液的粒徑和PDI均為最小，說明此時乳化劑能在液滴界面形成較好的吸附層，從而維持納米乳液的穩定性。因此選取油相質量分數為1%。

2.1.4 超聲時間對納米乳液的形成和穩定的影響

超聲波技術是目前制備食品級納米乳液的新技術之一，制備的納米乳液具有粒徑小、穩定性高、乳化劑使用量少、高效環保等特點[16-17]。本環節控制乳清蛋白與OSA變性淀粉質量比為7∶3，乳化劑質量分數為5%，油相質量分數為1%，超聲功率360 W，考察超聲時間對納米乳液穩定性的影響。超聲時間從3 min增加到28 min，納米乳液粒徑和PDI呈現先快速減小后緩慢減小的趨勢(圖4)，說明進行一定時間的超聲處理可以改善納米乳液的穩定性和分散狀態。超聲時間為3、8 min的納米乳液粒徑(> 208 nm)較大，并且在76 h時乳液表面產生白色薄層絮凝物，說明其穩定性相對較差。超聲時間從13 min增加到28 min，納米乳液粒徑從197 nm逐漸減小到172 nm，PDI值基本保持不變(圖4)。

圖4 超聲時間對納米乳液的形成和穩定的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the formation and stabilization of nanoemulsions

在所研究的范圍內，超聲時間越長，納米乳液的粒徑越小，在室溫下保持穩定的時間越長。原因可能是超聲波產生的物理效應破壞了乳清蛋白分子間的相互作用，使原來在乳清蛋白內部的疏水基團暴露在乳清蛋白表面，從而增加乳清蛋白的表面疏水性[18]，降低了乳清蛋白的界面張力，進而使乳清蛋白在油/水界面處的遷移速率加快，形成致密的界面膜。此外，JAMBRAK等[19]對乳清蛋白進行超聲處理，發現超聲處理后乳清蛋白的粒徑和分子質量均顯著減小，增加了乳清蛋白及其水解物的溶解度。此時乳清蛋白表面積增大，乳清蛋白在油/水界面處可能更快地吸附。綜合考慮納米乳液的穩定性和超聲設備使用過程中的能量消耗，選取超聲時間為23 min。

2.1.5 超聲功率對納米乳液的形成和穩定的影響

本環節固定乳清蛋白與OSA變性淀粉質量比為7∶3，乳化劑質量分數為5%，油相質量分數度為1%，超聲時間為23 min，考察超聲功率對納米乳液穩定性的影響。超聲功率從120 W增加到240 W，納米乳液的粒徑變化不顯著(P>0.05)；超聲功率從240 W增加到360 W，納米乳液的粒徑顯著(P<0.05)減小了5 nm (圖5)。這可能是因為當超聲功率達到一定值時，隨著超聲功率的增加，超聲產生的空化氣泡數量增加，氣泡周圍能量增強，液滴更容易分散，從而使納米乳液的粒徑減小，穩定性更好[20-21]。超聲功率在360 W的基礎上增大時，納米乳液的粒徑存在減小趨勢，但變化不顯著。因此選取超聲功率360 W。

圖5 超聲功率對納米乳液的形成和穩定的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the formation and stabilization of nanoemulsions

2.2 環境因素對乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液穩定性的影響

2.2.1 pH

當乳清蛋白納米乳液的pH降低到4時，其粒徑顯著增大至2 100 nm，并且在短時間內(143 h)繼續迅速增大(圖6)，出現分層現象，說明此時的納米乳液極不穩定，這可能是因為此時pH在乳清蛋白等電點附近，液滴容易發生聚集而使粒徑增大[22]。通過乳清蛋白和OSA變性淀粉組合制備的納米乳液在pH=4處的粒徑顯著減小(圖6)至280 nm，說明添加OSA變性淀粉能有效減小乳清蛋白納米乳液在其等電點處的粒徑變化。

A-乳清蛋白納米乳液;B-乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液圖6 pH對乳清蛋白納米乳液和乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液穩定性的影響Fig.6 Effect of pH on the stability of nanoemulsions prepared with whey protein and with whey protein-OSA modified starch

這可能是因為OSA變性淀粉多分支結構形成的空間位阻可進一步穩定液滴，在蛋白質等電點附近增加納米乳液的穩定性[11]。這提示了在偏酸性(蛋白質等電點附近)條件下，添加一定量OSA變性淀粉可以在一定程度上增強乳清蛋白納米乳液的穩定性。

2.2.2 離子強度

不同Na+濃度(0.2～1.0 mol/L)對乳清蛋白納米乳液沒有顯著(P>0.05)影響，納米乳液的粒徑基本保持在170 nm左右(圖7)。在乳化劑中添加OSA變性淀粉后，Na+濃度從0增大到0.6 mol/L的過程中，納米乳液的粒徑無顯著變化(圖7)，說明低Na+濃度對乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液粒徑無顯著(P>0.05)影響。當Na+濃度從0.6 mol/L增大到0.8 mol/L時，乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液的粒徑由190 nm顯著(P<0.05)增大到197 nm(圖7)。這可能是因為在較低Na+濃度下，液滴間的靜電排斥作用可以克服疏水相互作用和范德華力[23]；但當Na+濃度大于臨界濃度(0.6 mol/L)時，Na+能夠中和乳清蛋白和OSA變性淀粉分子的負電荷，削弱液滴間的靜電排斥作用，使液滴間發生聚集，從而增大納米乳液的粒徑。

A-乳清蛋白納米乳液;B-乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液圖7 Na+濃度對乳清蛋白納米乳液和乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液穩定性的影響Fig.7 Effect of sodium ion concentration on the stability of nanoemulsions prepared with whey protein and with whey protein-OSA modified starch

隨著Ca2+濃度的增加，納米乳液的粒徑呈現明顯的上升趨勢。Ca2+濃度從0增大到0.004 mol/L過程中，乳清蛋白納米乳液粒徑變化不顯著；從0.004 mol/L增大到0.032 mol/L過程中，乳清蛋白納米乳液的粒徑顯著增加了38 nm(圖8)。在乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液中，Ca2+濃度從0增加到0.004 mol/L，納米乳液粒徑顯著(P<0.05)增加17 nm(圖8)，說明Ca2+濃度很低時，乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液中液滴易發生聚集，從而導致粒徑增加。Ca2+的靜電屏蔽作用和離子結合效應，導致納米乳液粒徑增大，穩定性降低[24-25]。Ca2+濃度從0.004 mol/L增大到0.024 mol/L過程中，乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液的粒徑顯著(P<0.05)增加了90 nm(圖8)。綜上可知，Ca2+對納米乳液粒徑的影響比Na+大，這是因為多化合價離子的靜電屏蔽作用比單化合價離子強，在低濃度下可屏蔽更多的電荷數[26]。

A-乳清蛋白納米乳液;B-乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液圖8 Ca2+濃度對乳清蛋白納米乳液和乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液穩定性的影響Fig.8 Effect of calcium ion concentration on the stability of nanoemulsions prepared with whey protein and with whey protein-OSA modified starch

2.2.3 熱處理

不同溫度(40～90 ℃)處理下乳清蛋白納米乳液的粒徑無顯著(P>0.05)變化，乳清蛋白納米乳液粒徑基本保持在172 nm左右(圖9)。這表明僅通過乳清蛋白穩定的納米乳液具有良好的熱穩定性，這可能是因為納米乳液中的液滴之間的強靜電排斥，避免了高溫下液滴表面上蛋白質分子間的相互作用[27]。經熱處理后的2種納米乳液均在室溫下保存7 d而無液滴絮凝的現象。乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液粒徑基本維持在184 nm左右，除了溫度升高到90 ℃ 時，乳液粒徑有增大的趨勢(圖9)。這提示了在乳化劑中添加一定量OSA變性淀粉后，一定溫度下(40～80 ℃)納米乳液的粒徑沒有顯著變化。

A-乳清蛋白納米乳液;B-乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液圖9 溫度對乳清蛋白納米乳液和乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液穩定性的影響Fig.9 Effect of temperature on the stability of nanoemulsions prepared with whey protein and with whey protein-OSA modified starch

3 結論

以乳清蛋白-OSA變性淀粉為復合乳化劑，通過超聲均質法成功制備的乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液的粒徑為(182.5±1.3) nm，PDI為(0.19±0.01)。通過穩定性試驗發現，在pH=4時，乳清蛋白納米乳液粒徑極大，為2 100 nm。而乳清蛋白和OSA變性淀粉組合制備的納米乳液的粒徑減小到280 nm。當pH>6時，2種納米乳液粒徑基本保持不變，穩定性較好。在Na+濃度小于0.6 mol/L時，乳清蛋白-OSA變性淀粉制備的納米乳液的粒徑沒有顯著變化；在考察的Ca2+濃度下，乳清蛋白-OSA變性淀粉制備的納米乳液粒徑增大幅度大于乳清蛋白制備的納米乳液。乳清蛋白-OSA變性淀粉納米乳液粒徑在40～80 ℃下無顯著變化，納米乳液的粒徑在該溫度下能保持較好的穩定性。