補料工藝對乳桿菌CHU-R產蝦青素的影響

何俊杰，宋光均，鄧慧萍，蹇華麗*

1(華南農業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州，510642) 2(廣州元大生物科技發(fā)展有限公司，廣東 廣州，510530)

蝦青素(astaxanthin)屬于酮式類胡蘿卜素，是一種強抗氧化劑，具有清除自由基，修復自由基和紫外線導致的細胞膜和核酸損傷，增強免疫力，抗腫瘤等功效，被廣泛應用在醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品、飼料添加等領域[1-4]。目前，發(fā)酵法生產蝦青素所使用的菌種主要是紅法夫酵母和雨生紅球藻，但因存在產量不高、培養(yǎng)周期長、培養(yǎng)條件苛刻、提取難度大等方面的問題，一定程度上制約了其生產和應用[5-7]；因此，蝦青素產量高、生產工藝簡單、易于培養(yǎng)和大規(guī)模生產的產蝦青素生物資源一直是人們研究和尋求的目標。

本課題組分離獲得1株產蝦青素乳桿菌CHU-R，前期試驗表明該菌種同時具備雨生紅球藻高蝦青素含量和紅發(fā)夫酵母易培養(yǎng)的特點[8-10]，且在蝦青素提取方面表現(xiàn)出優(yōu)良性能，通過分批培養(yǎng)，其蝦青素含量約為20.0 mg/g干菌體[11-13]。本研究擬采用補料分批發(fā)酵進一步提高其生物量及蝦青素產量，通過研究補料方式對其各指標的影響確定最佳補料工藝。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

乳桿菌CHU-R[14](由華南農業(yè)大學天然農藥與化學生物學重點實驗室饋贈)，華南農業(yè)大學食品學院生物工程實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：去皮切塊馬鈴薯200.0，蔗糖20.0，瓊脂粉20.0，pH 6.0；種子制備培養(yǎng)基(g/L)：糖蜜15.0(以總糖含量計)，(NH4)2SO42.0，Na2HPO4·12H2O 1.0，pH 6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：糖蜜20.0(分批發(fā)酵為70.0，以總糖含量計)，(NH4)2SO42.0，Na2HPO4·12H2O 1.0，pH 5.0；補料液濃度(g/L)： 糖蜜200.0(以總糖含量計)，(NH4)2SO420.0，Na2HPO4·12H2O 10.0，pH 4.0～4.5；補料量約占總裝料體積20%，以上培養(yǎng)基的濕熱滅菌條件為121 ℃，20 min。

1.2 儀器與設備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD超凈工臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；BIOTECH-7BGZ 5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；TGL-16GR臺式冷凍高速離心機，上海安亭科學儀器廠；Aglinet 1100高效液相儀，Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子制備

將斜面菌種接種于盛有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于28 ℃、180 r/min搖床內培養(yǎng)24 h，獲得一級種子。然后，取2.5 mL一級種子液置于盛有50 mL新鮮種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，于相同條件培養(yǎng)16 h，獲得二級種子。

1.3.2 5 L發(fā)酵罐實驗

分批發(fā)酵：以5% 接種量將二級種子液接入裝料系數為0.8的5 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度28 ℃，控制溶氧50%左右，壓強0.08 MPa，發(fā)酵pH 5.0(使用15% NaOH和20% H3PO4控制)，溶氧≥50%，培養(yǎng)周期72 h，每8 h取樣測定菌體干重及蝦青素產量。

以過程pH為補糖依據的補料分批發(fā)酵：采用流加方式，當碳源基本耗盡，即pH較基礎值上升0.5時開始補料，調節(jié)流加速率使每次加入發(fā)酵液的糖含量分別為5.0、10.0、15.0、20.0 g/L，直至發(fā)酵液中總補糖量達50.0 g/L。其余操作條件與分批發(fā)酵相同。

以總糖消耗為補糖依據的補料分批發(fā)酵：采用流加方式，當發(fā)酵液中殘?zhí)呛窟_到設定值(3.0～6.0、6.0～9.0和9.0～12.0 g/L)開始補料，直至發(fā)酵液中總補糖量達50.0 g/L。其余操作條件同分批發(fā)酵。

以過程DO為補糖依據的補料分批發(fā)酵：采用流加方式，當DO升高到80%為補料依據進行補料，直至發(fā)酵液中總補糖量達50.0 g/L，控制DO值分別維持在20%～40%和40%～60%，其余操作條件同分批發(fā)酵。

1.3.3 總糖測定

參照GB/T 5009.7—2016直接滴定法[15]。

1.3.4 菌體干重測定

取10 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心10 min，除去上層液體，將菌體轉移到稱量瓶中，無菌水洗滌2次，置于105 ℃烘箱中干燥至恒重，獲得菌體凈重。根據取樣液體積，計算干重濃度(g/L)。細胞得率計算如公式(1)：

(1)

1.3.5 蝦青素產量測定

蝦青素標準曲線繪制：準確稱取0.001 g蝦青素標準品(Sigma，美國)，用少量丙酮溶解，并用甲醇定容至10.0 mL，此時標準溶液質量濃度為100.0 μg/mL。從中取一定量的標準溶液分別稀釋至2.5、5.0、10.0、 15.0、20.0 μg/mL。使用高效液相色譜法進行檢測，以質量濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標制作標準曲線。

蝦青素測定：吸取一定量細胞懸浮液，4 000 r/min離心10 min，除去上層液體，無菌水洗滌2次，95%乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌1次，加入一定量二甲基亞砜，將菌體重懸、攪拌均勻后于65.0 ℃水浴1 h，加入適量丙酮，搖勻后于4 000 r/min離心10 min，取上清液采用高效液相色譜儀進行檢測并根據標準曲線定量分析。

色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18、(4.6×250) mm、5.0 μL；檢測波長：480 nm；流動相：甲醇；流速：1.0 mL/min；柱溫30.0 ℃；進樣量：20.0 μL。

蝦青素細胞產率的計算如公式(2)：

(2)

1.3.6 數據處理與計算

數據統(tǒng)計結果采用“平均值±標準差”形式表示，應用SPSS 19.0軟件對數據進行方差分析和顯著性檢驗(顯著性水平為P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 分批發(fā)酵

為了研究補料工藝對乳桿菌CHU-R生長代謝的影響，首先在5 L發(fā)酵罐中對其進行分批發(fā)酵培養(yǎng)，其發(fā)酵過程曲線如圖1所示。

圖1 乳桿菌CHU-R分批發(fā)酵曲線Fig.1 Batch fermentation of Lactobacillus CHU-R

分批發(fā)酵結果表明，蝦青素積累和菌體生長前期相偶聯(lián)，后期不偶聯(lián)[16]；乳桿菌CHU-R生長的同時，蝦青素迅速開始積累；當乳桿菌CHU-R進入對數生長期，蝦青素同時進入快速積累期。40 h后，乳桿菌CHU-R對碳源的總消耗速率減慢，菌體生長速率相應放緩，但蝦青素積累速率卻并未減緩，表明菌體的生長和蝦青素積累在不同時期仍有所側重；前期主要進行菌體生長，而后期主要進行蝦青素積累。當菌體生長及蝦青素積累速度均漸趨平緩時，培養(yǎng)液中的殘?zhí)呛咳韵鄬^高，推斷原因可能是高濃度底物對菌體生長產生了抑制效應或者是產物的反饋抑制影響了乳桿菌CHU-R的生長和蝦青素的積累[17-18]，從而導致了發(fā)酵周期延長，碳源的利用率極低，因此有必要進行補料分批發(fā)酵。

2.2 以過程pH為補糖依據的補料方式

以過程pH為依據的補料方式中，當pH略有上升時表明培養(yǎng)基的營養(yǎng)基本消耗完畢，此時若補加物料進去，有利于乳桿菌的生長，減緩菌體衰老和抑制自溶，促進產物蝦青素的積累[19-20]。

發(fā)酵至17 h，pH較基礎值上升0.5時開始補料，通過流加補料液控制pH值維持在5.0，補料液流加時長為24 h，發(fā)酵結束時乳桿菌CHU-R共加入物料70.0 g/L糖蜜(以總糖含量計)、7.0 g/L(NH4)2SO4和3.5 g/L Na2HPO4·12H2O。由圖2可知，4種補糖濃度的菌體干重和蝦青素產量變化趨勢具有相似性，32 h達到穩(wěn)定期，菌體干重維持在25.0～30.0 g/L。當補糖質量濃度為20.0 g/L時，生物量達到最大值(32.43 g/L)， 不同時間下的蝦青素產量在40 h前有較顯著差異(最高值為1.39 g/L)，表明以過程pH為補糖依據的補料模式中，每次補糖后，流加濃度的差異對乳桿菌CHU-R生長及蝦青素積累雖有一定影響，但幅度不大；綜合考慮成本因素，以流加濃度20.0 g/L 較為合適。在16 h前培養(yǎng)液中的初糖被迅速消耗，因為在17 h進行補料，發(fā)酵液中全程保持一定濃度的可利用碳源，菌體可維持一定的生長活力，殘?zhí)堑暮烤S持在3.0～8.0 g/L。與分批發(fā)酵相比，以過程pH為補糖依據的補料模式能顯著提高乳桿菌CHU-R菌體量、蝦青素積累量及對殘?zhí)堑睦寐省?/p>

圖2 以過程pH為補糖依據對乳桿菌CHU-R發(fā)酵過程的影響Fig.2 Effect of process pH as supplementary sugar on fermentation process of Lactobacillus CHU-R

2.3 以總糖消耗為補料依據的補料方式

以總糖消耗為補料依據，是補料分批發(fā)酵中較為簡單有效的一種底物補加策略。在此補料方式中，當發(fā)酵至12～16 h殘?zhí)菨舛冗_到補糖設定值時開始補料，通過流加補料液控制殘?zhí)菨舛染S持在設定值，補料液流加時長為25～30 h，發(fā)酵結束時乳桿菌CHU-R共加入物料70.0 g/L糖蜜(以總糖含量計)、7.0 g/L(NH4)2SO4和3.5 g/L Na2HPO4·12H2O。如圖3所示，3種補糖方式的菌體干重變化趨勢具有相似性，差異較小；穩(wěn)定期時菌體干重維持在25.0～30.0 g/L，最大值為32.96 g/L；然而，不同補糖方式的蝦青素產量具有明顯差異，而且，以6.0～9.0 g/L為設定值開始補糖的方式所得效果最佳。

圖3 以總糖消耗為補料依據對乳桿菌CHU-R發(fā)酵過程的影響Fig.3 Effect of total sugar consumption on the fermentation process of Lactobacillus CHU-R

這些結果表明補糖時機非常重要，補糖太早，發(fā)酵液中維持較高糖濃度，很可能不利于蝦青素積累。與分批發(fā)酵相比，該發(fā)酵方式，維持了合適的碳源濃度，顯著提高了乳桿菌CHU-R菌體量、蝦青素積累量及對碳源的利用率,實驗結果與盧富山等[21]利用葡萄糖反饋流加維持較低的糖濃度從而提高植物乳桿菌數結果相似。

2.4 以過程DO為補料依據的補料方式

由于該乳桿菌產蝦青素是一個強好氧過程，因此培養(yǎng)液的溶氧濃度是影響菌體生長和蝦青素合成的重要因素。當培養(yǎng)液的溶氧降低到一定水平時，溶氧的供應就無法滿足其生長需求[22]，導致蝦青素產量降低。

在該補料工藝中，發(fā)酵至15～16 h開始補料，通過流加補料液控制溶氧濃度維持在設定值，補料液流加時長為35 h，發(fā)酵結束時乳桿菌CHU-R共加入物料70.0 g/糖蜜(以總糖含量計)、7.0 g/L (NH4)2SO4和3.5 g/L Na2HPO4·12H2O。由圖4可知，在以過程DO為補料依據進行補料時，控制溶氧40%～60%的菌體干重和蝦青素產量均高于溶氧20%～40%，且前者的殘?zhí)呛康陀诤笳摺Ｆ渲校刂?0%～60%溶氧的補料方式下，穩(wěn)定期時，菌體干重保持在33.0～36.0 g/L(最高值39.73 g/L)，蝦青素產量維持在1.20～1.50 g/L。實驗表明，較高的溶氧量使乳桿菌CHU-R充分利用發(fā)酵液中的殘?zhí)牵箽執(zhí)呛烤S持在較低水平，提高了殘?zhí)堑睦寐剩瑥亩龠M了乳桿菌CHU-R的生長和提高蝦青素產量。

圖4 以過程DO為補料依據對乳桿菌CHU-R發(fā)酵過程的影響Fig.4 Effect of process DO as feeding basis on fermentation process of Lactobacillus CHU-R

2.5 不同補料方式發(fā)酵結果比較

根據上述不同補料分批發(fā)酵結果選擇具有代表性時刻對3種補料方式的殘?zhí)呛窟M行分析比較，結果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)3種補料工藝的殘?zhí)菨舛炔町愶@著(P<0.05)。

圖5 不同補料方式發(fā)酵液中殘?zhí)琴|量濃度變化趨勢Fig.5 Trend of residual sugar concentration in fermentation broth with different feeding modes注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

以過程pH為補糖依據的補料工藝是一種基于響應pH值變化的補料策略[23]，因乳桿菌CHU-R是偶聯(lián)的，蝦青素積累可能更多利用發(fā)酵液中的有機酸等代謝產物，導致乳桿菌CHU-R未完全利用完發(fā)酵液中的碳源的情況下，觸發(fā)了補料機制致使補料前期乳桿菌CHU-R對發(fā)酵液的碳源利用率較低，最終因產物反饋抑制或者滲透壓升高等其他原因使乳桿菌CHU-R生長受到影響。

然而在以總糖消耗為依據的補料方式中，雖然全程嚴格控制碳源濃度，使得碳源濃度完全滿足乳桿菌CHU-R的生長需求，但陳敏純等[14]前期研究表明乳桿菌CHU-R生長和蝦青素積累過程是好氧過程，乳桿菌CHU-R的快速生長會導致氧需求量不斷增加，在此補料策略過程中，發(fā)酵液中的溶氧含量隨著發(fā)酵時間越來越低，最終因發(fā)酵設備的供氧能力限制而不能滿足乳桿菌CHU-R對氧氣的需求，從而抑制了乳桿菌CHU-R的生長，因此發(fā)酵結果與以過程pH為補糖依據的補料工藝相似，無法達到最佳效果。

補料工藝的關鍵是確保基質消耗速率和補料流加速率的平衡，使發(fā)酵過程中基質濃度維持在合適范圍，降低滲透壓和菌種生存環(huán)境變動以減小對菌體活力的損傷[24]。在以過程DO為補糖依據的補料方式中，在保證供氧的情況下以溶氧濃度變化來判斷補料時機，雖全程碳源濃度相對較低，但基本可以滿足乳桿菌CHU-R生長需求，結合圖5顯著性差異分析，發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葘θ闂U菌CHU-R發(fā)酵過程有較大影響，而且，在發(fā)酵過程中保持菌體處于半饑餓狀態(tài)，可以刺激乳桿菌CHU-R的生長和產物的積累，因而其可以充分利用發(fā)酵液中的碳源，使發(fā)酵液的殘?zhí)菨舛鹊陀谄渌麅煞N補料工藝，既保證了原料的利用率，同時進一步提高了乳桿菌CHU-R菌體量和蝦青素積累量，與桑美納等[25]通過補料方式將碳源濃度和溶解氧濃度同時控制在適中水平從而提高頭孢菌素C濃度效果方法一致。

乳桿菌CHU-R分批發(fā)酵及以過程pH為補糖依據、以總糖消耗為補料依據、以過程DO為補料依據的補料方式下，最佳的菌體生長和蝦青素合成情況如表1所示。

結果表明，相比分批發(fā)酵，3種補料工藝均能顯著提高乳桿菌CHU-R的菌體干重、蝦青素產量和細胞得率，其中，以過程DO為補糖依據的補料工藝能提高乳桿菌CHU-R生物量至2.6倍，蝦青素產量至2.8倍，但其對提高蝦青素細胞產率效果不顯著，原因可能是雖然通過提高每升發(fā)酵液中的乳桿菌CHU-R菌體量而提高了蝦青素總產量，但對于單菌的蝦青素積累量卻沒有顯著提高。關于如何進一步提高單菌的蝦青素積累量，僅靠補料工藝難以達到理想的效果；因其涉及到蝦青素合成代謝途徑和代謝控制，若想顯著提高單菌的蝦青素積累量，需對乳桿菌CHU-R產蝦青素的機制進行全面研究。

表1 乳桿菌CHU-R不同補料分批發(fā)酵工藝結果Table 1 Lactobacillus CHU-R different fed-batch fermentation process results

3 結論

在本研究中，乳桿菌CHU-R作為蝦青素的生產菌株，在5 L反應器中進行分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵，其中補料分批發(fā)酵的方式有3種，其補料依據分別是過程pH、總糖消耗和過程DO。經過大量試驗發(fā)現(xiàn)，相對分批發(fā)酵對照組，本研究中采用的3種補料方式均可顯著提高植物乳桿菌CHU-R的生物量及其蝦青素積累量，其中以過程DO為補糖依據的補料分批發(fā)酵可達到最高，該發(fā)酵過程中的乳桿菌CHU-R生物量和蝦青素產量(最大值)分別是39.73 g/L和1.88 g/L，是分批發(fā)酵對照組的2.6和2.8倍，同時，該發(fā)酵全程保持著較高的溶氧量和較低卻足夠的糖濃度，有利于乳桿菌CHU-R生長和蝦青素積累。