采后熱水處理對青椒果實低溫貯藏期間活性氧代謝及抗氧化物質的影響

邵婷婷，張敏,2,3,4*，劉威，姜雪，趙昱瑄，郝爽，厲建國，盧瑛

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，上海，201306) 4(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海，201306)

青椒果實由于其自身的高營養價值而深受廣大消費者的青睞。由于青椒果實原產于南美，是一種季節性較強的呼吸躍變型冷敏果蔬，采摘之后在常溫下不易貯藏，極易失水萎蔫、腐敗變質，使其外觀品質和貯藏性大大降低，因此青椒的貯藏保鮮就顯得尤為重要。目前人們大多數采用低溫貯藏的方式來延長其貯藏期限，但在低溫貯藏時，青椒果實由于其冷敏性的特點極易受到冷害而導致其可食用價值和商品價值大大降低，并造成嚴重的經濟損失。其中冷害是指高于0 ℃的低溫對產自于熱帶、亞熱帶的果實造成的生理代謝失調和組織傷害[1-2]。青椒果實的適宜貯藏溫度為(7～9) ℃[3-6]，當青椒的貯藏溫度低于這個溫度范圍時就會出現冷害現象。由于冷害現象的發生，使得低溫運輸及貯藏受到了一定的限制。因此，需要找到適當的貯前處理方式來解決這一問題。有關青椒果實的貯前處理方式常見的有化學保鮮劑處理、涂膜處理、天然提取物處理以及熱處理等方式[7]。其中熱激處理技術結合低溫貯藏的方式對保持果蔬品質新鮮,延長貯藏期很有效，有著很好的應用前景[8-17]。在常見的熱處理方式中，短時間的熱水浸泡處理被認為是最有效的熱處理方式[18]。但目前關于同一有效熱水處理溫度下不同處理時間對青椒果實低溫貯藏期間的活性氧代謝及抗氧化系統的影響之間的研究還未有人涉及。本次試驗研究同一熱水處理溫度下不同的熱水處理時間對青椒果實的活性氧代謝和抗氧化物質的變化情況，以期為青椒果實貯藏保鮮的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青椒：選用“洛椒”青椒作為試驗材料，于2018 年6月 4日采于上海市南匯新城鎮果園，裝于泡沫箱中當天運回實驗室。

鹽酸羥胺、Na2HPO4、乙二胺四乙酸、對氨基苯磺酸、α-萘胺、DTT、三氯乙酸、二硫代硝基苯甲酸、還原性谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、硫代巴比妥酸(分析純):國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BPS-100CA型恒溫恒濕培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；H-2050R-1型高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司； THZ-82A型恒溫振蕩箱，江蘇省金壇市環宇科學儀器廠；BJ2100D型數字孔式電子天平，臺灣精達電子儀器有限公司；DDS-307型電導率儀，上海笛柏實驗設備有限公司；HSWX-600BS型電熱恒溫水溫箱，上海圣科儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青椒預處理

挑選大小一致、形狀規整、果皮堅硬有光澤、無明顯機械損傷、無病蟲害的新鮮青椒果實裝于泡沫箱中當天運回實驗室。果實平均長度為14～17 cm，平均質量為60～90 g。將青椒果實清洗干凈后拭干備用。根據前期試驗結果，選取有效熱水處理溫度為44 ℃，來研究該溫度下處理青椒果實2、7、12、17和22 min，另外不經過熱水處理的設為對照組，進而研究不同的熱水處理時間對青椒果實的低溫貯藏期間細胞內活性氧代謝及抗氧化物質的影響。將各組青椒果實處理后放于干凈的實驗臺上晾干再裝入厚度為0.03 mm的聚乙烯保鮮袋，最后放于(4±0.5) ℃相對濕度為(80±5)%的冷庫中貯藏，整個貯藏周期為21 d，每隔2 d取出青椒樣品觀察各組的冷害指數并測定其他各項品質及生理生化指標，重復3次。

1.3.2 品質指標與測定方法

(1)冷害指數的測定

冷害指數是評價果蔬冷害程度很直觀的一個指標。參照侯建設等[19]的方法來對青椒果實的冷害指數進行評定。通過觀察青椒果實果面所呈現出的冷害面積將冷害癥狀分為4級。其中，0級：無冷害癥狀；1級：輕微冷害，冷害斑不超過果面的10%；2級：中度冷害，冷害斑占果面積的10%～40%；4級：嚴重冷害，冷害斑超過果面的40%。

(1)

(2)失重率的測定

在貯藏前用電子天平將每個新鮮青椒果實稱重并記為G0，將青椒從冷庫中取出后置于干凈的實驗臺上并用紙拭干，再用電子天平稱重并記為G。每組青椒稱重之后再將其放入新的厚度為0.03 mm的聚乙烯保鮮袋(打若干個1 cm的孔)中于冷庫中貯藏。用公式(2)計算出青椒的失重率。

(2)

(3)電解質外滲率的測定

參考陳健華等[20-21]的測定方法，稍作修改，用DDS-307電導率儀測定。選取較為平整的青椒果面，用打孔器取10個圓片放入有編號的燒杯中，并添加20 mL去離子水后將燒杯放于轉速為150 r/min，環境溫度為25 ℃的恒溫振蕩箱(THZ-82A，江蘇省金壇市環宇科學儀器廠)內振蕩10 min，振蕩后取出燒杯并用去離子水反復沖洗3次，用濾紙將青椒圓片表面的水分拭干，把圓片再次放入燒杯中，重新加入20 mL去離子水，測定此時的電導率值，并記為Ro。測定結束后把燒杯放于真空干燥器(規格：240 mm，上海帥登儀器有限公司)中60 min。之后取出燒杯再次放入恒溫振蕩培養箱中振蕩1 h，振蕩結束后取出測定此時的電導率并記為R。用保鮮膜覆于燒杯上并把燒杯于沸水中煮沸10 min，煮沸結束后靜待恢復至室溫，測定此時的電導率R′。記錄試驗結果，并用公式(3)來算出電導率。

(3)

(4)丙二醛含量的測定

MDA含量測定分光光度計分別測定450、532和600 nm的吸光值，并利用公式(4)計算測定青椒果實的MDA含量。

c/(μmol·L-1)=6.45×(A532-A600)-0.56×A450

(4)

(6)過氧化氫酶(CAT)活性的測定

CAT在催化H2O2分解成為水和分子氧的過程中，起到電子傳遞的作用，因此，可根據反應過程中H2O2的消耗量來測定該酶的活性。H2O2在波長240 nm 處具有吸收峰，利用分光光度計可以檢測H2O2含量的變化。其中CAT活性測定以每克果肉1 min 內OD240值變化0.01為1個酶活單位。

(7)谷胱甘肽還原酶(GR)活性的測試

在還原型輔酶(NADPH)提供氫的條件下，GR能將氧化性谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，同時NADPH形成NADP+。NADPH在波長340 nm處具有吸收峰，因此可以通過測定OD340的減小來計算GR的活性。反應系統中每分鐘OD340變化0.1為1個酶活性單位。

(8)還原型谷胱甘肽(GSH)的測定

谷胱甘肽是一種天然三肽，能和二硫代硝基苯甲酸產生一種黃色物質，該物質在波長412 nm處具有最大光吸收，因此利用分光光度計法可測定青椒果實中GSH的含量。

1.3.3 數據分析

數據采用Excel 2010軟件處理，SPSS 19.0 軟件繪圖進行差異性分析。本文所有試驗為3次重復，試驗結果為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 不同熱處理條件對青椒果實冷害指數的影響

冷害指數是評價果蔬細胞冷害情況的一個很直觀、很重要的指標,可以直接反映出果蔬遭受低溫冷害的程度[23]。在青椒果實的整個低溫貯藏期間，由于青椒果實所處的環境溫度低于其冷害發生的臨界溫度[24]，所以隨著貯藏時間的延長，各組青椒果實的冷害癥狀就逐漸顯現，但不同處理組的青椒果實的冷害發生時間以及冷害程度又有所差別。由圖1可以看出，各組冷害發生時間先后順序為CK=22 min=17 min =7 min>2 min>12 min。

圖1 不同熱處理時間對青椒果實冷害指數的影響Fig.1 Effects of different heat treatment time on cold damage index of green pepper fruits

隨著貯藏時間的延長，各組青椒果實的冷害癥狀之間的差別就愈加明顯。貯藏到12 d時，44 ℃熱水處理12 min組青椒果實剛開始出現冷害癥狀，其值為12.5%，而2、7、17、22 min以及CK組的冷害指數分別為25%、43.8%、40.6%、41.7%和53.1%。在整個低溫貯藏期間，12 min處理組青椒果實的冷害指數一直都維持在較低水平，遠遠小于其他處理組，到貯藏結束時，12 min處理組青椒果實的冷害指數僅為對照組的36%。而其他各處理組青椒果實的冷害指數在貯藏后期都有大幅度的增加，其中 2、7、12、17、22 min和CK組青椒果實的冷害指數分別達到了37.5%、54.2%、59.4%、62.5%和68.9%，均顯著高于12 min組的冷害指數25%(P<0.05)。可能是因為在貯藏初期的青椒果實冷害癥狀不是很明顯，隨著低溫貯藏時間的延長，各組青椒果實的冷害癥狀才隨之加劇，而12 min組青椒果實較低的冷害指數則說明該條件可以有效減輕青椒的冷害癥狀。

2.2 不同熱處理條件對青椒果實失重率的影響

新鮮的青椒果實果肉較厚且含水量較高，具有很好的外觀品質以及很高的營養價值。但采摘后的青椒果實為了延長貯藏期常將其貯于低溫環境中。處于低溫環境下的青椒果實由于受到低溫逆境的傷害難免會出現失水皺縮、果皮變軟等現象。如圖2所示，隨著低溫貯藏時間的延長，由于不同熱水處理時間下的青椒果實都有一定程度的失水現象，所以青椒果實的失重率呈現出一直上升的趨勢，但不同處理組下青椒果實的失重率的上升情況差異也較明顯。

圖2 不同熱處理時間對青椒果實失重率的影響Fig.2 Effects of different heat treatment time on weight loss rate of green pepper fruits

在整個低溫貯藏期間，各個熱處理組青椒果實的失重率都始終低于對照組，但22 min處理和對照組青椒果實的失重率接近，二者之間無顯著性差異。第9天時，12 min組青椒果實的失重率僅為0.95%，而22 min組和CK組已經分別達到了2.91%和3.07%，遠遠高于12 min處理組。對于2、7和17 min處理組青椒果實的失重率來說，其數值也高于12 min處理組。該結果說明熱水處理時間較長或較短都不能很好達到抑制失重率增加的效果，12 min處理可以增強青椒果實在低溫貯藏期間的抗逆性，進而抑制其失重率的大幅度增加，使青椒果實的失重率維持在較低的水平，有利于青椒果實的進一步貯藏。

2.3 熱處理對電解質外滲率的影響

采后的青椒果實在低溫貯藏時因為遭受了低溫逆境的傷害，其細胞內會發生過氧化反應，進而造成青椒果實細胞膜的膜脂狀態發生改變，減弱了膜脂分離的流動性，改變了原生質內部的隔離狀態，使得青椒果實細胞內的細胞膜透性增加，細胞結構的完整性受到破壞，從而導致果實軟化腐爛[25-26]。LYONS[27]研究得出果蔬細胞在處于低溫逆境中時，最先受到影響的就是生物細胞膜當中的組成成分的狀態。因此，電解質外滲率這一指標其值越高，說明果蔬細胞的細胞膜受損害的程度就越嚴重[28]。由圖3可知，各處理組青椒果實的電解質外滲率均隨著貯藏時間的延長而增加，這說明各組青椒果實細胞均受到了不同程度的傷害，膜脂狀態也發生了一定程度的改變，進而體現在電解質外滲率數值的變化。不同處理組青椒果實的電解質外滲率增加的幅度不同，說明各處理組下的青椒果實對逆境的抗性不同。對于12 min處理組的青椒果實來說，其電解質外滲率一直維持在一個較低的水平，說明該處理組下的青椒果實在低溫逆境下有了很好的抗性，進而能夠保護細胞的膜脂狀態，減少細胞內營養物質的滲漏，維持了較低的電解質外滲率值。在貯藏前期，其他各組青椒果實的電解質外滲率都有一個明顯的上升過程，而12 min青椒果實的電解質外滲率值僅增加了3%。12 min處理組青椒果實在21 d時其電解質外滲率的數值僅為54%，是對照組青椒果實電解質外滲率的78%。而22 min處理組青椒果實的電解質外滲率在貯藏結束時甚至達到了70%，稍高于對照組青椒果實的電解質外滲率。出現該結果的原因可能是長時間的熱水處理使青椒果實細胞在應對低溫逆境時的抗性減小。在整個低溫貯藏期間，12 min處理組的青椒果實的細胞膜完整性維持的最好，該處理組下的青椒果實的抗性高于其他各組(圖3)。

圖3 不同熱處理時間對青椒果實電解質外滲率的影響Fig.3 Effect of different heat treatment time on electrolyte extravasation rate of green pepper fruit

2.4 熱處理對丙二醛(MDA)含量的影響

膜脂過氧化現象就是指細胞膜上的結構骨架磷脂分子被氧化，生成過氧化產物丙二醛，丙二醛的累積會破壞細胞膜的完整性[29]。由圖4可知，在貯藏前期，各處理組青椒果實的丙二醛含量均出現了一個輕微的下降過程，從第6天開始一直到低溫貯藏結束，各組青椒果實的丙二醛含量均持續增加，且不同處理組下的青椒果實丙二醛含量也呈現出來不同的增加幅度。各個處理組當中，增加幅度最明顯的為對照組，其數值由貯藏初期的0.000 32 μmol/g增加到0.002 μmol/g。增加幅度最小的是12 min處理組，在貯藏結束時，其數值為0.001 μmol/g，明顯小于其他各處理組(P<0.05)。且在貯藏后期，各組青椒果實的丙二醛含量增加的幅度比前期要高，這可能是由于長期的處于低溫逆境中青椒果實內的膜脂過氧化反應加劇，使得丙二醛大量積累。青椒果實細胞內的丙二醛含量的變化跟電解質外滲率這一指標之間有著一定的聯系。因為這兩種指標的變化都跟青椒果實細胞的細胞膜膜脂狀態的改變有關。當青椒果實處于低溫環境中時，其細胞膜的完整性受到破壞，加之細胞內過氧化反應的進行，過氧化產物的積累使得青椒果實的抗逆性減弱。由結果可知，12 min熱水處理組使青椒果實的丙二醛含量維持在一個較低的水平，表明該處理條件下的青椒果實細胞內的過氧化程度較低，細胞所受的逆境傷害最小。

圖4 不同熱處理時間對青椒果實MDA含量的影響Fig.4 Effect of different heat treatment time on MDA content of green pepper fruit

2.5 熱處理對超氧陰離子產生速率的影響

圖5 不同熱處理時間對青椒果實產生速率的影響Fig.5 Effect of different heat treatment time on production rate of green pepper fruit

2.6 熱處理對CAT活性的影響

CAT分解H2O2生成H2O和O2分子，能夠有效地清除自由基。不同熱水處理時間青椒果實的CAT酶活性的變化如圖6所示。

圖6 不同熱處理時間對青椒果實CAT活性的影響Fig.6 Effects of different heat treatment time on CAT activity of green pepper fruits

結果表明，CAT酶活性呈現出先增大后減小的趨勢。由各組青椒果實在整個低溫貯藏期間CAT的活性變化可知，各組CAT活性均在第9天達到峰值，隨后則下降。各處理組青椒果實CAT活性的峰值分別為5.37、4.52、6.91、 5.25、5.24和4.58 U/(g·min)。由圖6可以看出，12 min處理組青椒果實的CAT活性一直高于其他各組，即使到了貯藏后期，12 min處理組青椒果實的CAT活性雖然有所降低，但降低的幅度卻維持在較低的水平，貯藏到第21天時，12 min處理組青椒果實的CAT活性仍然高達4.21 U/(g·min)，為對照組的1.91倍。CAT酶活性的變化趨勢反映了青椒果實細胞內的活性氧清除水平。12 min組青椒果實的CAT活性一直高于其他處理組，說明該處理條件下的青椒果實的活性氧代謝維持在較低的水平，細胞受活性氧物質的傷害程度最小。因此，12 min處理下的青椒果實清除活性氧的能力處在一個較高的水平，提高了青椒果實在低溫期間對逆境的抗性，增加了細胞的自我保護能力。

2.7 熱處理對谷胱甘肽還原酶活性的影響

圖7 不同熱處理時間對青椒果實GR活性的影響Fig.7 Effects of different heat treatment time on GR activity of green pepper fruits

12 min處理組青椒果實的GR活性一直高于其他各組。在第9天時各組青椒果實的GR均達到峰值，其中12 min處理組青椒果實的GR活性高達29.85 U/mg，其他各組青椒果實的GR活性除了17 min組的為21.75 U/mg外，其他各組均低于20 U/mg。各組青椒果實的GR活性不僅是峰值大小的差別，即使在貯藏結束時，12 min處理組青椒的GR活性仍然較高，維持在15.64 U/mg，是對照組的2.72倍。青椒果實在低溫貯藏期間由于受到低溫逆境的影響，其細胞內會發生一系列的活性氧代謝，此時青椒果實細胞中的GR就會保持一種較高的活性來應對，由上述結果可知，12 min處理組的青椒果實的GR的活性較高，對青椒細胞內產生的活性氧起到了很好的清除作用，降低了青椒果實低溫貯藏期間的逆境傷害，是一種很好的熱處理條件。

2.8 熱處理對還原型谷胱甘肽含量的影響

圖8 不同熱處理時間對青椒果實GSH含量的影響Fig.8 Effects of different heat treatment time on GSH content of green pepper fruits

3 結論