紫菜發酵提取物的體外降血脂功能分析

鄧茜瑩，李緩緩，曾榮急，李桂玲,2，劉靜雯，李健,2*

1(集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門，361021)2(福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建 廈門，361021)

紫菜是一種深受人們喜愛的食品，營養豐富，其蛋白質的含量遠高于一般的蔬菜和其他食用海藻，且含有大量的牛磺酸[1-2]。但是由于紫菜細胞壁的構成，采用傳統的加工方式無法使得紫菜中豐富的營養成分充分溶出而被人體消化吸收。為了更好地利用紫菜這種富含優質蛋白質的藻類，可以采用發酵的方式進行破壁處理，現代研究表明，食品被發酵的本質是由于微生物分解代謝食物中的營養物質得到新的次生代謝物質和轉化物質賦予發酵食品獨特的風味和營養[3-7]。例如生活中常見發酵制品醬油、腐乳等，經過微生物發酵之后，不僅品質風味發生了明顯的改變，最重要的是豆制品的成分也發生了不同程度的變化。

據報道，采用微生物發酵可以提高海藻中可溶性成分的利用率[8]。釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌對豆粕進行發酵后使得豆粕本身的蛋白質被分解，從而獲得低分子質量的優質蛋白飼料[9]。近年來諸多研究發現紫菜多糖具有降血脂、抗氧化[10-11]的作用，如紫菜多糖能降低高血脂癥大鼠體內總甘油三酯和膽固醇含量，從而有效預防大鼠的高膽固醇血脂癥形成[12]；利用蛋白酶對紫菜進行酶解，可以制備具有抗氧化活性的多肽[13]。然而通過微生物發酵紫菜后的體外降血脂功效的研究還鮮有報道。

本研究采用釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)以固態、液態兩種發酵方式發酵紫菜，并對發酵產物采用加水、乙醇分別浸提以得到粗提物。利用非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liverdisease,NAFLD)細胞模型對紫菜發酵提取物的體外降血脂活性進行研究，為紫菜發酵提取物的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，來自集美大學保藏菌種；壇紫菜，購于集美新華都超市；LO2人肝細胞株，集美大學食品與生物工程學院。

1.2 主要試劑

軟脂酸(分析純)，阿拉丁公司；油酸、油紅O(分析純)，西亞試劑有限公司；噻唑藍(MTT，98%標準品)，美國Sigma公司；檢測蛋白質含量試劑盒，碧云天；檢測甘油三酯(total triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TCH)試劑盒，南京建成。

1.3 主要儀器與設備

DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機，青州市精誠機械有限公司；5810R高速冷凍離心機，德國艾本德股份有限公司；SynergyH1酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；MM-2微型振板器，上海精密儀器有限公司；240I CO2恒溫細胞培養箱，賽默飛世爾科技有限公司；XDS-2倒置顯微鏡，廣州粵顯光學儀器有限責任公司。

1.4 紫菜發酵提取物的制備

參照文獻[14-15]做出適當改進。選取壇紫菜于50 ℃恒溫干燥箱中干燥3 h，粉粹干燥機粉碎后，80目過篩。稱取紫菜粉末，按照料糖比5∶3(g∶g)加入蔗糖，料液比1∶0.5和1∶0.9(g∶g)加入蒸餾水，分別為固態、液態發酵。攪拌均勻后放入高壓蒸汽鍋中滅菌20 min，取出冷卻后紫外滅菌30 min。酵母組發酵條件為：溫度28 ℃，發酵時間72 h，接種量1%。枯草芽孢桿菌組除發酵溫度為37 ℃外，其余的條件均與酵母組相同。每個菌種固態、液態發酵樣品各2份，分別用于加水、乙醇進行提取粗提物。

發酵結束后，向各菌種的2份固態發酵產物中分別加入100 mL蒸餾水和乙醇，充分混勻后，浸提1 d，4 ℃，10 000 r/min離心20 min。收集上清液經旋轉蒸發后，將加水浸提所得粗提物以蒸餾水定量為100 g/L 樣品液，即為水提物；將加乙醇浸提所得粗提物以含體積分數10%的DMSO的超純水定量為100 g/L 樣品液，即為醇提物。將各菌種的2份液態發酵產物經旋轉蒸發蒸干后，向殘留固體中分別加入100 mL蒸餾水和乙醇，其余處理同上。

空白組以紫菜干粉加入1∶20(g∶mL)蒸餾水，于磁力攪拌器室溫浸提1 d，10 000 r/min離心20 min，浸提2次，收集上清后真空冷凍干燥得到干粉，以蒸餾水配制成100 g/L的母液。

1.5 紫菜發酵后營養組分含量測定

1.5.1 紫菜發酵后蛋白質含量測定

采用碧云天蛋白質測定試劑盒測定0～4號紫菜發酵水提物中蛋白質含量，凱氏定氮法測定紫菜中蛋白質的含量。蛋白提取率為發酵水提物中蛋白含量(g)與紫菜中總蛋白含量(g)的百分比。

1.5.2 紫菜發酵后還原糖含量測定

采用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖[16]，用葡萄糖配制成質量濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的標準液，用蒸餾水做空白。取2 mL的標準液，加1.5 mL的DNS溶液，搖勻后在沸水浴中加熱5 min。冷卻后以蒸餾水定容至25 mL。混勻后，取微量反應液用酶標儀在540 nm處測定，制定標準曲線。樣品測定時，取樣品2 mL如上述操作測定，以標準曲線計算樣品中的還原糖量。還原糖提取率為發酵水提物中還原糖含量(g)與紫菜中還原糖含量(g)的百分比。

1.6 紫菜發酵提取物的體外降血脂功能活性研究

1.6.1 細胞培養及分組

參考文獻[17-22]有所改動。LO2細胞培養于含有體積分數為10%的胎牛血清和體積分數為1%的抗生素的DMEM(高葡萄糖)培養液中，于體積分數為5%CO2、37 ℃ 培養箱中培養。實驗分為對照組、模型組、不同濃度的8種紫菜發酵提取物和紫菜浸提物干預組、陽性對照組。其中對照組以DMEM(高葡萄糖)培養基培養；模型組以含終濃度為0.6 mol/L 游離脂肪酸(free fatty acids, FFA，V(油酸)∶V(軟脂酸)=2∶1) 培養液處理；樣品干預組以5和1 g/L的9種培養液處理；陽性對照組以1 g/L洛伐他汀培養液處理。

1.6.2 細胞活力測定

將對數生長期的細胞接種于96孔板，調整細胞密度為1×104個/孔，待細胞貼壁后吸出培養液，各干預組分別加入各濃度紫菜發酵提取物和紫菜浸提物培養72 h后，同模型組一起分別加入0.6 mol/L FFA繼續培養24 h后，將細胞培養液棄去，收獲細胞后采用MTT法測定細胞活力。根據公式(1)計算細胞活力：

(1)

1.6.3 細胞內脂質堆積半定量測定

將對數生長期的細胞接種于96孔板，調整細胞密度為1×104/孔，其余處理同1.6.2，收獲細胞后，PBS清洗，用體積分數為10%的中性甲醛溶液固定30 min后，再以PBS清洗，油紅避光染色40 min。染色完成后，以體積分數為60%的異丙醇溶液快速清洗，加PBS二次清洗，于顯微鏡40倍下觀察細胞形態[23]。

觀察過后，加入體積分數為60%的異丙醇溶液，室溫靜置40 min，振板10 min，在528 nm處檢測吸光值，根據公式(2)計算脂變率：

(2)

1.6.4 細胞內TG、TC含量測定

將對數生長期的細胞接種于6孔板，其余處理同1.6.2，收獲細胞后，PBS清洗、離心后加入200 μL PBS重懸，于液氮中反復凍融破碎細胞，離心取上清，按照試劑盒說明書操作測定TG、TC含量。

1.7 數據處理

數據統計分析采用SPSS statistics 17.0軟件程序進行，采用單因素方差分析和Duncan檢驗進行統計學檢驗(置信水平P= 0.05)。

2 結果與分析

2.1 紫菜發酵水提物中可溶性蛋白質得率

通過測定紫菜發酵水提物上清液中蛋白質的含量，可知紫菜經酵母菌和枯草芽孢桿菌發酵后的水提物中水溶性蛋白質含量有所增高，見圖1。

a-蛋白質；b-還原糖圖1 發酵上清液中蛋白質、還原糖得率Fig.1 Protein and reducing sugar yield of fermentation supernatant

可溶性蛋白質含量增加可能是發酵菌體分泌的多種酶裂解紫菜細胞壁使得其中含有的營養成分充分釋放，菌體分泌的蛋白酶水解蛋白質大分子為短肽。因研究目的在于通過微生物發酵破壁的方式獲得具有生物活性的短肽，因此只選定發酵液中的可溶性蛋白質含量進行測定。不同發酵形態的發酵產物之間蛋白質含量無顯著差異，不同菌種發酵產物中的蛋白質含量也無顯著差異(P< 0.05)。

2.2 紫菜發酵水提物中還原糖得率

通過DNS法測定紫菜發酵水提物上清液中還原糖的含量，其含量的變化間接反映兩種微生物的生長狀態。由圖1可知發酵后還原糖含量極顯著下降(P< 0.01)，這是由于還原糖在發酵過程中被微生物生長代謝所利用，因而含量明顯下降。其中2(酵母菌液態發酵紫菜水提物)和3(枯草芽孢桿菌固態發酵紫菜水提物)中的還原糖含量高于1(酵母菌固態發酵紫菜水提物)和4(枯草芽孢桿菌液態發酵紫菜水提物)，說明酵母菌在液態發酵時對糖的利用率高于固態發酵，枯草芽孢桿菌在固態發酵時對糖的利用率高于液態發酵。

2.3 紫菜發酵提取物在NAFLD細胞模型中的應用

2.3.1 發酵提取物對細胞活力的影響

采用MTT法評估紫菜發酵提取物作用下的細胞毒性，見圖2。

圖2 提取物對LO2細胞活力對的影響Fig.2 MTT assay of extracts to the LO2 cell

結果表明，紫菜發酵提取物在指定濃度下對LO2細胞活力無顯著影響，細胞活力均在體積分數80%以上，說明紫菜提取物無顯著細胞毒性，并具有良好的細胞相容性。

2.3.2 發酵提取物對細胞內脂質堆積的影響

通過油紅O染色觀察不同濃度紫菜發酵提取物干預下影響FFA誘導處理細胞后胞內脂滴分布情況，見圖3-a。

結果表明，5 g/L的7(枯草芽孢桿菌固態發酵醇提物)、8(不同濃度的枯草芽孢桿菌液態發酵醇提物)干預下，細胞內脂滴相較于模型組FFA明顯減少，細胞輪廓變得不清晰，且5 g/L的8(枯草芽孢桿菌液態發酵醇提物)相較于陽性藥物洛伐他汀的70%抑脂率無統計學差異(P< 0.05)，見圖3-b，說明枯草芽孢桿菌液態發酵醇提物可以有效抑制細胞內脂滴形成。另外，在1 g/L的4(枯草芽孢桿菌液態發酵水提物)干預下細胞內脂滴相較于模型組FFA也有所減少，對細胞的抑脂率為41%，說明該水提物對胞內脂質堆積也有一定的抑制作用。

2.3.3 發酵提取物對細胞內TG、TC含量的影響

通過測定細胞內TG、TC的含量，結果表明，1 g/L的紫菜發酵提取物對細胞內TG含量無明顯影響，5 g/L 的4(枯草芽孢桿菌液態發酵水提物)處理后胞內TG含量相較于模型組FFA下降了30%，見圖4。

5 g/L的0(紫菜浸提物)、不同質量濃度下的7(枯草芽孢桿菌固態發酵醇提物)、8(枯草芽孢桿菌液態發酵醇提物)處理細胞后，TC含量相較于模型組FFA顯著下調(P< 0.05)。

a-胞內脂質堆積; b-抑脂率圖3 油紅染色后發酵提取物對細胞內脂質堆積的影響和半定量檢測發酵提取物對細胞的抑脂率Fig.3 Effect of extracts to intracellular lipid accumulation and semi-quantitative detection of lipid suppression rate of fermentation extract to LO2 cells

a-TG含量；b-TC含量圖4 紫菜發酵提取物對細胞內TG和TC含量的影響Fig.4 Effect of extract on intracellular TG and TC content

3 結論

本研究在進行降血脂活性研究之前，通過HPLC對各個發酵提取物中物質成分及含量的差異性進行了分析，發現紫菜發酵前后的成分及含量有顯著差異，同時通過研究發現紫菜發酵后水溶性蛋白質含量顯著升高，這可能是由于菌體分泌的蛋白酶水解蛋白質大分子為低分子質量蛋白所致，這與馬文強等[9]的研究結果一致。說明紫菜通過微生物發酵破壁的方式，可以更好地獲得優質蛋白質，促進紫菜在體內的消化吸收，使得紫菜的營養價值得到提高。

利用NAFLD細胞模型的篩選結果發現紫菜發酵提取物對游離脂肪酸誘導細胞中脂滴的形成有抑制活性，其中枯草芽孢桿菌液態發酵水提物對胞內總甘油三酯(TG)有一定的下調作用，枯草芽孢桿菌固、液態發酵醇提物對總膽固醇(TC)含量具有顯著下調作用，而發酵提取物對細胞內脂滴形成的抑制作用高于未發酵的紫菜浸提物，這說明紫菜發酵后的產物可能具有降血脂的活性。STEINKRAUS[24]、KIERS等[25]研究發現可以利用微生物發酵將蛋白質大分子水解為多肽、氨基酸等一些小分子物質。HONG等[26]研究表明，經Aspergillusoryzea發酵后，豆粕中蛋白質大分子降解為< 20 ku的小分子肽。邵偉等[27]研究發現豆粕經枯草芽孢桿菌發酵后將大豆蛋白水解為多肽，且得到的多肽經研究發現具有促進微生物生長、降血脂等生理活性。因此推測發酵提取物中具有降血脂活性的物質可能是酵母菌和枯草芽孢桿菌菌體分泌的酶將紫菜中的大分子蛋白質水解為的小分子肽，這還有待進一步的分離純化鑒定，為紫菜的活性研究提供理論基礎。