檸檬形克勒克酵母和釀酒酵母混合發酵對臍橙全果酒風味物質的影響

鄭淑丹，陳鋼，闕發秀，萬聆，鄧山鴻，簡素平

(食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學)，江西 南昌，330047)

果酒是由酵母經過一系列復雜的微生物反應發酵而來的，酵母在整個過程中起著關鍵作用。依據酵母的功能特點，一類是釀酒酵母，其具有較高的酒精發酵力，發酵效率也較快[1]；另一類是非釀酒酵母，可以產生多種酶類(蛋白酶、酯酶、糖苷酶、果膠酶等)，其中糖苷酶能水解原料中的非揮發性糖苷類前體物質，使其轉換為各種風味物質，如酯、高級醇、萜烯類等[2-3]。因此，充分利用兩類酵母的特性進行混合發酵實現“取長補短”，不僅可以增加風味物質的生成，還可以降低乙酸、乙醛等異味物質的含量，從而改善果酒的口感和風味[4-5]。有研究表明，在混合同時發酵的過程中，非釀酒酵母在發酵初期發揮著主要作用，但因其耐酒精力較差、對營養物質的競爭力弱等缺陷[6-7]，在發酵1～3 d后，釀酒酵母將其取代成為優勢菌株，限制了非釀酒酵母對果酒風味物質形成的貢獻[8]。因此，本論文研究了非釀酒酵母和釀酒酵母在混合培養時的接種順序對酵母生長及風味物質的影響，使兩種酵母的特性得以充分展現，從而為釀造品質更佳的臍橙果酒提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍橙,江西省贛州地區信豐市；食品級白砂糖,深圳安泰生物科技有限公司；釀酒酵母、檸檬形克勒克酵母(K.apiculata) 1466,中國工業菌種保藏中心；果膠酶(酶活力>50 000 U/g),上海源聚生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀(食品級),長沙科迪亞實業有限公司；3-辛醇(色譜純),美國Sigma公司；β-環糊精(分析純),廣州一碼生物有限公司；賴氨酸培養基(LYS)、酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養基、營養瓊脂(WL)培養基,青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HR1882型榨汁機，飛利浦(中國)投資有限公司；MP2002電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；WYT-J型手持糖度計，成都光學廠；SPX-250B-Z型生化培養箱，上海博迅實業有限公司；pH S22型數顯酸度計，Sartorius公司；酒精計，上海精密科學儀器有限公司；VS-1300型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；微量移液器，上海熱電儀器有限公司；5975-6890N GC-MS聯用儀，美國Agilent公司；二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 臍橙全果酒釀造工藝流程[9]

1.3.2 臍橙全果酒的接種方式

酵母活化：將釀酒酵母和檸檬形克勒克酵母分別劃線于YPD固體培養基上，在恒溫箱中(30 ℃)培養48 h。隨后分別取一環平板活化的酵母于50 mL YPD液體培養基中，在恒溫振蕩培養箱中(30 ℃，150 r/min) 培養24 h，將培養好的酵母放在冰箱中(4 ℃) 保藏備用。

接種方式：同時接種，將釀酒酵母和檸檬形克勒克酵母同時接入200 mL的臍橙全果酒發酵液中，接種量均為6 lg CFU/mL。

順序接種：先接種檸檬形克勒克酵母(6 lg CFU/mL)，72 h后再接種釀酒酵母(6 lg CFU/mL)。

以釀酒酵母和檸檬形克勒克酵母的單獨發酵作為對照，接種量均為6 lg CFU/mL。

1.4 指標測定

1.4.1 常規理化成分分析[10]

酒精度,酒精計法；糖度,手持折光儀法；殘糖含量,斐林試劑滴定法；SO2測定,直接碘量法；pH值,采用pH S22型酸度計定。理化指標重復測定3次。

1.4.2 酵母計數

由于釀酒酵母在賴氨酸瓊脂培養基(LYS)上不能生長，所以用賴氨酸培養基對非釀酒酵母進行計數，用WL培養基對釀酒酵母進行計數，均采用平板計數法。

1.4.3 GC-MS分析[11-12]

將固相微萃取萃取頭在GC-MS儀的進樣口老化，老化溫度250 ℃，老化時間30 min，載氣流速1.0 mL/min。

取10 mL臍橙酒樣于25 mL螺口進樣瓶中，加入內標物3-辛醇(400 μg/L) 5 μL和0.1 g/mL NaCl溶液，密封置于45 ℃水浴中平衡30 min。平衡后插入經過老化處理的固相微萃取頭，頂空萃取40 min后，再將萃取頭插入GC進樣口，解吸5 min。

1.4.3.1 色譜條件

色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 mm)；升溫程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min的速率升到160 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min的速率升至230 ℃， 保持3 min；He流量1.0 mL/min；無分流進樣；進樣口溫度：250 ℃。

1.4.3.2 質譜條件

電子電離源；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；電子能量70 eV；燈絲發熱電流0.25 mA；掃描速率全程33～450m/z。

1.4.3.3 香氣成分分析

定性定量分析：運用計算機譜庫(NIST/WILEY)進行初步檢索及資料分析，并結合已有的相關文獻進行定性分析。可根據內標物3-辛醇(400 μg/L)進行定量分析，采用峰面積法計算出其含量。氣味活度值(odour activity value, OAV)分析如公式(1)。

(1)

式中：ρ，香氣物質質量濃度，mg/L；T，感官閾值，mg/L。

主成分分析：采用SPSS 17.0軟件，對不同香氣成分進行主成分分析。

1.4.4 感官評定

參照GB/T 10220—2012 《感官分析方法學總論》要求組建感官評定小組(20人)[13]，參考GB/T 15038—2006 制定評分標準，并依據該標準對臍橙全果酒進行感官評分，取其平均值作為評分結果。感官評分標準見表1。

表1 臍橙酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of navel orange wine

2 結果與分析

2.1 發酵過程中酵母數量的變化

酵母對果酒最終風味特性的貢獻在很大程度上取決于發酵過程中酵母數量的持久性。發酵過程中酵母數量的動態變化如圖1、圖2所示。在釀酒酵母和檸檬形克勒克酵母的單獨發酵過程中，前48 h內2種酵母均處于快速增長階段，但檸檬形克勒克酵母的生長速率要低于釀酒酵母。釀酒酵母在第3天達到最大值(8.26 lg CFU/mL)，而檸檬形克勒克酵母的最大值(7.41 lg CFU/mL)則在第5天達到。

圖1 不同培養條件下混合同時發酵過程中酵母的變化Fig.1 Yeast quantity in mixed simultaneous fermentation under different inoculating conditions

圖2 不同培養條件下混合順序發酵過程中酵母的變化Fig.2 Yeast quantity in mixed sequential fermentation under different inoculating conditions

當釀酒酵母和檸檬形克勒克酵母混合發酵時，由于營養物質、空間的競爭，以及酵母之間的相互抑制，兩種酵母的最大細胞量均比單獨發酵時小[14]。當兩種酵母同時接種時，釀酒酵母優先利用營養物質而迅速增值，而檸檬形克勒克酵母則由于較弱的競爭力以及釀酒酵母代謝物的抑制，生長較為緩慢[15]。當2種酵母順序接種時，使檸檬形克勒克酵母生長到一定數量后，再接種釀酒酵母，從而減弱檸檬形克勒克酵母的劣勢，延長了其生長時間。

2.2 香氣成分分析

高級醇是由相應的氨基酸通過Ehrlich途徑轉化，或是糖的分解代謝產生的[16]，是果酒中的主要香氣物質。異丁醇、異戊醇、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇在不同方式發酵的臍橙全果酒中含量均較高，均具有水果的甜香和醇香，且能持久保存[17]，是臍橙果酒典型的香氣成分。另外，2-癸醇只在非釀酒酵母單獨發酵和順序發酵時發現，而1-壬醇只存在于釀酒酵母單獨發酵和同時發酵中。釀酒酵母生成高級醇的能力較強[18]，單獨發酵時，釀酒酵母合成的高級醇是檸檬形克勒克酵母的1.5倍。另外，同時發酵時高級醇的含量相比釀酒酵母單獨發酵增加了3.17%，可能是由于發酵后期檸檬形克勒克酵母衰亡，其自身分解為營養物質被釀酒酵母所利用[19]。但是，順序發酵時某些高級醇的含量卻有所下降，這與檸檬形克勒克酵母將其轉化為酯類有關[20]。

酸類物質是酵母代謝的次級產物，也是合成酯的前體物質。當有非釀酒酵母存在時，會將大部分乙酰輔酶A用于酯的合成，而合成脂肪酸的乙酰輔酶A不足，從而導致酸類物質含量偏低[7]。臍橙全果酒中存在的酸類為乙酸、己酸和辛酸，這些酸少量存在時可以為臍橙酒帶來一定的乳酪、脂肪香味，但含量過高則會對酒體的香氣和品質帶來負面影響[21]。因此，混合發酵在減少酸類物質產生不良影響方面具有一定作用。

酯類物質是果酒中香氣成分的重要貢獻者。臍橙全果酒中乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯的含量最高，為增添酒中香氣的復雜性和典型性有一定的貢獻[22]。非釀酒酵母的產酯能力高于釀酒酵母，在發酵過程中能產生更多的酶，從而將醇和酸通過酯酶合成途徑轉化為酯[23]。因此，混合發酵酒中大多數酯類物質的含量均高于單獨發酵酒，且混合順序發酵時含量更多。表明先接種檸檬形克勒克酵母，延長了其存活時間，有利于合成更多的酯類物質[24]。

萜烯類物質在賦予果酒花果的芳香方面起著重要作用。臍橙全果酒中萜烯類化合物含量均占香氣成分的30%以上。順序發酵酒中的萜烯類物質的種類和含量均最多，且里哪醇、D-檸檬烯的含量要明顯高于同時發酵，反式相芹醇也只存在于混合順序發酵酒中，這些萜烯類化合物可以給予臍橙全果酒更獨特更濃郁的橙香和甜香[25](表2)。

2.3 氣味活度值(OAV)分析

香氣成分濃度和貢獻率并不一定成正比，還與其閾值有關。OAV反映了香氣成分揮發性的大小及難易程度，能較客觀地體現香氣成分對酒風味的影響[26]。當OAV值>1時，其對香氣的呈現有較大的貢獻。

由表3分析可知，醇類物質的OAV值均<1，但在協調臍橙酒的口感和風味方面起著不可忽視的作用。酸類物質中，乙酸的OAV值>1，但過量的乙酸會使果酒產生不愉快的脂肪味和刺鼻的味道[21]，混合順序發酵酒中乙酸的OAV值最低，有利于減少其帶來的不良風味。酯類物質中，辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯的OAV值均>1。其中，乙酸異戊酯和己酸乙酯的OAV值較大，且混合發酵酒中其值明顯高于單獨發酵酒，賦予臍橙全果酒更濃郁的花果香、茴香和蜜糖味。除純釀酒酵母發酵酒中的橙花叔醇外，萜烯類化合物的OAV值均>1，對整體酒質結構起著重要作用。D-檸檬烯和里哪醇被視為臍橙全果酒的特征香氣成分，嗅覺閾值低，OAV值高，賦予其愉悅的甜香、花果香，以及獨特的臍橙風味[25]。酯類和萜烯類物質大多數情況下，混合順序發酵酒中含量最高，OAV值最大，香氣特征最突出。

表2 臍橙全果酒風味物質Table 2 Flavor components of different navel orange wine

注：“-”代表未檢測出。下同。

表3 臍橙全果酒風味物質的OAV分析Table 3 OAVs of flavor components in different navel orange wine

2.4 主成分分析

為進一步探究4種臍橙全果酒的差異所在，對酒中的風味物質含量進行主成分分析。主成分1和主成分2的方差貢獻率分別為57.57%，30.26%，二者累計貢獻率已達到87.83%，基本可以體現臍橙全果酒中的風味物質信息，因此選取前2個主成分進行分析。

因子載荷系數反映了臍橙全果酒中各風味物質對各主成分的影響，相關系數越大，該物質在主成分中的代表性就越強[27]。里哪醇(0.985)、4-萜品醇(0.986)、薄荷酮(0.974)、癸酸乙酯(0.961)、香茅醇(0.941)、丙酸香芹酯(0.949)、乙酸苯乙酯(0.943)、薄荷醇(0.957)、橙花叔醇(0.960)和對乙基苯酚(0.968) 與主成分1高度正相關；而乙酸(-0.966)、己酸(-0.863)、辛酸(-0.895)和1-壬醇(-0.584)與主成分1呈高度負相關；異戊醇(0.916)、異丁醇(0.968)、正辛醇(0.963)、正己醇(0.983)、乙偶姻(0.860)和苯乙醇(0.906) 與主成分2呈高度正相關；β-松油醇(-0.788)、反式香芹醇(-0.568)、丁酸乙酯(-0.577)和苯甲酸乙酯(-0.611)與主成分2高度負相關。

這4種方式發酵的臍橙全果酒整體風味有較大的差異。混合發酵的臍橙酒均位于第一象限，主要風味物質比較接近。混合順序發酵酒中萜烯類物質(里哪醇、4-萜品醇、香茅醇、薄荷醇、橙花叔醇)對其影響更大，而醇類物質(正己醇、異丙醇)在混合同時發酵酒中更豐富。檸檬形克勒克酵母單獨發酵酒位于第四象限，β-松油醇、苯甲酸乙酯、丁酸乙酯、反式香芹醇、月桂酸乙酯、2-癸醇、丙酸香芹酯是其主要風味物質；而純釀酒酵母發酵酒則位于第二象限，主要風味物質為辛酸、乙酸、1-壬醇、苯乙醇、異戊醇(圖3、圖4)。

圖3 不同揮發性成分的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of different volatile components

圖4 不同酒樣的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of different wine samples

2.5 不同方式發酵臍橙全果酒感官評定

由表4可知，4種臍橙全果酒外觀評分上比較接近，但在香氣和典型性方面有顯著的差異，純釀酒酵母發酵酒得分最低，混合順序發酵酒則最高。由于檸檬形克勒克酵母單獨發酵時不徹底，所得臍橙全果酒在滋味呈現上較差。綜合分析看來，混合順序發酵的臍橙全果酒感官評分最高(89.87)，且色澤澄清透明、酒體豐滿、臍橙香氣特征突出、風格典型獨特。

3 結論

不同接種方式發酵對臍橙全果酒風味物質的研究結果表明，采用先接種檸檬形克勒克酵母72 h后再接種釀酒酵母的混合順序發酵，減弱了非釀酒酵母的劣勢，在確保發酵順利完成的情況下使其發揮更有效的作用。通過GC-MS進行香氣成分的鑒定，并結合氣味活度值(OAV)進行分析，4種接種方式發酵的臍橙全果酒中共檢測到38種香氣成分，包括醇類9種、酯類11種，萜烯類9種、酮和酚類5種，其在定性和定量上均有一定的差異。雖然高級醇在果酒中的含量較高，但因其OAV值均<1，所以香氣特征不明顯。混合順序發酵酒中酸類物質含量最低，減少了其含量過高產生的不良影響。混合發酵酒中大多數酯類物質含量均高于單獨發酵，且混合順序發酵酒中含量更多。其中，辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯的OAV值均>1，增添了臍橙全果酒中香氣的復雜性和典型性。萜烯類化合物所占比例最大，OAV值均>1，且混合順序發酵酒中其種類和含量均最豐富，對臍橙全果酒獨特風味的呈現起著重要作用。通過主成分分析，4種方式發酵的臍橙全果酒在整體風味上有較大差異，混合發酵酒的主要風味物質相接近，純釀酒酵母發酵酒的風味最差，其結果與感官評分一致。綜合分析看來，混合順序發酵的臍橙全果酒，在檸檬形克勒克酵母和釀酒酵母的協同作用下，有效地促進了更多酯類、萜烯類物質的合成，增加了香氣成分的種類，改善了果酒的品質和風味，風格更加典型獨特。

表4 不同方式發酵臍橙全果酒感官評定表Table 4 Sensory evaluation of navel orange wine fermented in different ways