在明串珠菌中構建葡萄糖到甘露醇的轉化體系

金紅星，王星，彭鈺瑋

(河北工業大學 化工學院，天津，300130)

甘露醇(mannitol)是一種具有多種功效的六糖醇，被廣泛地應用于醫藥、食品、化工和電子等行業[1]。目前生產甘露醇的4種方法中，海藻提取法產生大量廢水、能耗高、污染嚴重；催化加氫法在高溫高壓、金屬催化和通氫氣條件下進行且產物分離困難[2]；酶轉化法需要昂貴的輔酶；微生物發酵法產甘露醇綠色清潔，是產業轉型升級的迫切需要。產甘露醇的細菌、酵母和絲狀真菌中，進行異型乳酸發酵的細菌(lactic acid bacteria, LAB)比較出色[1]。明串珠菌(Leuconostoc)、酒球菌(Oenococcus)和乳桿菌(Lactobacillus)等[3]異型乳酸發酵細菌，將果糖底物轉化為甘露醇。國內外的很多學者[4-8]研究了產甘露醇的發酵工藝。然而，南京工大的ZHANG等[9]認為，發酵法產甘露醇途徑經濟效益低的原因是發酵培養基成本高、果糖的滲漏而進入中心代謝、甘露醇產率低。因此，本課題組[10-11]通過多基因敲除、mdh(甘露醇脫氫酶)基因敲入改造了染色體，并考察了對腸膜明串珠菌發酵產甘露醇的影響，以相對廉價的蔗糖作為底物時，產率已經達到90%以上。

為進一步提高底物到目的產物的轉化率，在腸膜明串珠菌中擬引入同型乳酸發酵細菌產甘露醇的代謝途徑，即葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸→甘露醇[1, 12]。明串珠菌的PPK(戊糖磷酸解酮酶)代謝途徑存在2種酶的編碼基因，即催化葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸的葡萄糖激酶和催化葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸的磷酸葡萄糖異構酶[13]。因此，只要引入催化果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸的甘露醇-1-磷酸脫氫酶基因(mt1d)和催化甘露醇-1-磷酸→甘露醇的甘露醇-1-磷酸酶基因(m1p)，就可以在明串珠菌中構建由葡萄糖轉化為甘露醇的體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)CGMCC1.10327、大腸桿菌(E.coli)DH5α、質粒pUC19，均由本實驗室保存；腸膜明串珠菌ATCC8293、植物乳桿菌CGMCC1.2437、食淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorus)CGMCC1.3395，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

高保真的DNA聚合酶、T4DNA連接酶：謙泰生物技術有限公司；PCR純化試劑盒：Axygen公司；限制性內切酶：大連寶生物工程有限公司；氨芐青霉素：Sbase公司。引物由金唯智生物科技有限公司合成(表1)，m1p基因編碼序列由生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 培養基與培養條件

大腸桿菌用LB培養基培養，培養溫度為37 ℃；腸膜明串珠菌和植物乳桿菌用MRS培養基培養，培養溫度為30 ℃。

1.1.4 儀器與設備

Mastercycler?nexus PCR儀，Eppendorf;Gene Pluser XcellTM電轉化儀，Bio-Rad；LC-20AD CTO-20A高效液相色譜儀,Agilent。

1.2 方法

1.2.1mt1d-m1p串聯體的合成

以植物乳桿菌染色體DNA為模板，利用1對引物mt1d1/mt1d2 PCR擴增mt1d編碼序列；以腸膜明串珠菌ATCC8293染色體DNA為模板，利用1對引物ldhA1/ldhA2 PCR擴增D-ldh基因的表達元件；通過重疊延伸PCR將D-ldh基因表達元件和mt1d編碼序列連接成為mt1d基因表達盒。

根據GenBank中登錄號為AF032462的柔嫩艾美球蟲(Eimeriatenella)的m1p編碼序列，按照明串珠菌染色體的密碼子偏好性優化了核苷酸序列，并委托公司人工合成了DNA序列。利用2對引物ldhA3/ldhA4、m1p1/m1p2，通過重疊延伸PCR合成了m1p基因表達盒。

利用1對引物mt1de1/mt1de2 PCR擴增獲得的mt1d基因表達盒序列插入到pUC19的EcoRI和XbaI位點上，命名為pUC19-mt1d。利用1對引物m1pe1/m1pe2 PCR擴增獲得的m1p基因表達盒序列插入到pUC19-mt1d的KpnI位點上，成為mt1d-m1p表達盒串聯體。

1.2.2 同源重組載體的構建

利用2對引物dtsq1/dtsq2、dtsh1/dtsh2，通過重疊延伸PCR獲得的產物插入到pUC19的EcoRI和HindⅢ位點上，成為中間帶有XbaI識別序列的葡聚糖蔗糖酶基因的同源重組載體。

利用2對引物aldhq1/aldhq2、aldhh1/aldhh2，通過重疊延伸PCR獲得的產物插入到pUC19的EcoRI和HindⅢ位點上，成為中間帶有XbaI識別序列的乙醛脫氫酶基因的同源重組載體。

以食淀粉乳桿菌染色體DNA為模板，利用1對引物amyl/amyr通過PCR獲得的產物插入到同源重組載體XbaI位點上，成為中間帶有α-淀粉酶基因標記的同源重組載體。

以mt1d-m1p表達盒串聯體為模板，利用1對引物mtmpl/ mtmpr通過PCR獲得的產物插入到同源重組載體的XbaI位點上，成為中間帶有mt1d-m1p表達盒串聯體的同源重組載體。

1.2.3 突變菌株的構建和驗證

參照文獻[15]的方法進行明串珠菌的電擊轉化。通過2次同源重組獲得mt1d-m1p表達盒串聯體定點插入到染色體的突變菌株。第1次同源重組：用中間帶有α-淀粉酶基因標記的同源重組載體轉化初始菌株，在平板上獲得藍色的目的菌株，即靶基因失活、帶有標記基因的菌株。第2次同源重組：用中間帶有mt1d-m1p表達盒串聯體的同源重組載體轉化第1次同源重組獲得的目的菌株，在平板上獲得白色的目的菌株，即靶基因失活、定點插入mt1d-m1p表達盒串聯體的菌株。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

以染色體DNA為模板，利用1對引物aldhyq/aldhyh進行PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證aldh基因失活、帶有標記基因的菌株(Δaldh::amy)和aldh基因失活、定點插入mt1d-m1p表達盒串聯體的菌株[Δaldh::(mt1d-m1p)]。

1.2.4 發酵產甘露醇

野生型菌株和突變菌株用發酵培養基[14-15]進行搖瓶發酵20 h，用HPLC測定甘露醇含量。參照文獻[16-17]改進的檢測條件：檢測器為蒸發光散射檢測器(ELSD 6000)，色譜柱為Ultimate XB-NH2，流動相為V(乙腈) ∶V(水)=85∶15，流動相流速為：1 mL/min，柱溫為40 ℃，漂移管溫度為95 ℃，氣流流速為3L/min。

2 結果與分析

2.1 mt1d-m1p串聯體的合成

第1輪PCR擴增得到了預期長度為177 bp的D-ldh基因表達元件和1 164 bp的mt1d編碼序列(圖1-A，圖1-B)。第2輪PCR通過2個第1輪PCR產物末端的反向互補序列相互退火結合，構建成D-ldh基因表達元件和mt1d編碼序列連接在一起的DNA融合體。但是此時該融合體的量比較少，經過第3輪PCR特異性地擴增，成功得到了預期為1 341 bp的mt1d基因表達盒(圖1-C)。

M-Marker；1和2-D-ldh基因表達元件；3-mt1d編碼序列；4和5-mt1d表達盒。圖1 合成mt1d表達盒的重疊延伸PCRFig.1 Overlapping extension PCR for the synthesis of mt1d expression cassette

第1輪PCR擴增得到了預期長度為177 bp的D-ldh基因表達元件和946 bp的m1p編碼序列(圖2-A，圖2-B)。

M-Marker；1和2-D-ldh基因表達元件；3和4-m1p編碼序列；5-m1p表達盒圖2 合成m1p表達盒的重疊延伸PCRFig.2 Overlapping extension PCR for the synthesis ofm1p expression cassette

第2輪PCR利用2個第1輪PCR產物末端的反向互補序列相互退火結合，并通過8輪循環使2個DNA片段重疊延伸，經過第3輪PCR特異性地擴增，成功得到了預期為1 107 bp的m1p基因表達盒(圖2-C)。

將mt1d表達盒和m1p表達盒的串聯體連接到pUC19上命名為pUC19-mt1d-m1p，經EcoRI和XbaI雙酶切驗證結果(圖3)顯示，得到了預期為2 659 bp的線性pUC19和2 483 bp的插入片段。pUC19-mt1d-m1p的測序結果表明，插入片段序列與預期結果一致。

M-Marker；1-酶切結果圖3 pUC19-mt1d-m1p的酶切驗證Fig.3 Digestion verification of pUC19-mt1d-m1p

2.2 同源重組載體的構建

通過PCR驗證腸膜明串珠菌突變菌株的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖4，由圖4可知，2種突變菌株符合預期，即野生型腸膜明串珠菌菌株擴增的片段大小為1 125 bp、Δaldh::amy菌株擴增的片段大小為3 079 bp、Δaldh::(mt1d-m1p)菌株擴增的片段大小為3 417 bp， 說明在腸膜明串珠菌中成功構建了葡萄糖到甘露醇的體系。

1-野生型菌株(1 125 bp)；2-Δaldh::amy(3 079 bp)；3-Marker；4-Δaldh::(mt1d-m1p) (3417 bp)圖4 PCR驗證突變菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis map of mutant strain’s PCR verification

2.3 甘露醇的產量比較

腸膜明串珠菌不同菌株發酵產甘露醇的產量見圖5。

1-20 g/L葡萄糖為底物的Δaldh::(mt1d-m1p)；2-20 g/L蔗糖為底物的Δaldh::(mt1d-m1p)；3-20 g/L蔗糖為底物的野生型菌株；4-90 g/L蔗糖為底物的野生型菌株；5-90 g/L蔗糖為底物的Δaldh::(mt1d-m1p)；6-90 g/L蔗糖為底物的Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy；7-90 g/L蔗糖為底物的Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::(mt1d-m1p)；8-90 g/L蔗糖為底物的Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdh Δfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)圖5 野生型和突變型菌株的甘露醇產量Fig.5 Mannitol yield of wild-type and mutant-type strains

從圖5可以看出，(1) 以20 g/L葡萄糖為底物時，Δaldh::(mt1d-m1p)的甘露醇產量為2.52 g/L，異型乳酸發酵細菌-明串珠菌中已經構建成功了同型乳酸發酵細菌產甘露醇的代謝途徑；(2) 以20 g/L蔗糖為底物時，Δaldh::(mt1d-m1p)(9.69 g/L)的底物到甘露醇的轉化率比野生型(7.27 g/L)提高了33.29%；(3) 以90 g/L蔗糖為底物時，定點插入mt1d-m1p表達盒的菌株轉化率比野生型提高了很多，多基因敲除菌株[Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)]產量最高；(4) 以 90 g/L蔗糖為底物時，雙拷貝插入mt1d-m1p表達盒的菌株[Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::(mt1d-m1p)]比單拷貝插入菌株[Δaldh::(mt1d-m1p)、Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy]產量高，Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy比Δaldh::(mt1d-m1p)產量高，這是dts基因(葡聚糖蔗糖酶)失活造成的。

3 討論

近年來，本課題組一直從事著產甘露醇明串珠菌的遺傳育種工作。為了降低生產成本，以蔗糖代替葡萄糖、果糖作為底物進行了發酵產甘露醇的研究[18]。以蔗糖作為底物時，既可以在腸膜明串珠菌胞外由葡聚糖蔗糖酶催化生成葡聚糖和果糖，又可以進入胞內進行代謝[10]。為了使更多的蔗糖進入胞內進行代謝，刪除了單拷貝的葡聚糖蔗糖酶基因(dts)，從而提高了甘露醇的產量[15, 19]。由甘露醇脫氫酶催化果糖轉化為甘露醇時，需要NAD(P)H[10]。因此，刪除dts(Δdts)的基礎上，進一步刪除了代謝過程中消耗NAD(P)H的D-乳酸脫氫酶(D-ldh)和乙醛脫氫酶(aldh)編碼基因，進而又提高了甘露醇的產量[20]。腸膜明串珠菌中存在多拷貝的葡聚糖蔗糖酶基因[13]，故刪除了誘導表達葡聚糖蔗糖酶基因的雙組分系統成員-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[21]編碼基因(stpk)[10-11]。腸膜明串珠菌中除了存在乙醛脫氫酶基因外，還有乙醛脫氫酶-乙醇脫氫酶雙功能酶編碼基因[13]，故阻斷了PPK代謝途徑中乙酰磷酸到乙酰CoA 的反應(催化此反應的酶編碼基因為pat)[10-11]。使果糖激酶基因(fk)失活，以便幾乎所有的果糖轉化為甘露醇[10-11]。將3個拷貝的甘露醇脫氫酶基因(mdh)敲入到腸膜明串珠菌染色體中，以便提高甘露醇脫氫酶的酶活，進而提高產量[10-11]。最終，構建了高產甘露醇的菌株腸膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdh。為了進一步提高蔗糖到甘露醇的轉化率，本研究在Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdh(甘露醇產量為41.0 g/L)基礎上，在染色體的aldh位點上定點插入了mt1d-m1p表達盒串聯體，從而獲得了突變菌株Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)(47.26 g/L)，轉化率又提高了7%。在前期工作中發現，蔗糖底物為90 g/L時甘露醇產量最高[22]，故本研究采用了90 g/L的蔗糖底物。印度的RESHAMWALA等[12]以質粒形式在大腸桿菌過表達了mt1d、m1p和pxtD，因此進行發酵時必須加入抗生素而保持質粒的穩定性。本研究是在染色體上定點插入(mt1d-m1p)的，發酵時不需要加入抗生素。

開始啟動本研究時，企圖通過重疊延伸PCR將mt1d表達盒和m1p表達盒串聯在一起，但是所有的努力都以失敗而告終。這是2個表達盒所采用的相同的D-ldh基因表達元件在重疊延伸過程中相互干擾而造成的。通過PCR擴增第一個基因表達盒片段時，在引物中引入酶切位點識別序列，將第二個基因表達盒片段插入到這一位點，從而將2個表達盒串聯在一起了。

本研究通過構建葡萄糖到甘露醇的轉化體系，使出發菌株大幅度提高了甘露醇產量，但是改造的菌種還沒有達到生產中能夠采用的水平。微生物發酵生產甘露醇的方法，能否實際應用的瓶頸是生產成本，故從底物和菌株的遺傳育種角度還需要深入研究。例如，以甘蔗汁作為培養基[22]或以菊粉[23-25]作為底物，都可以降低發酵成本。

4 結論

以90g/L蔗糖為底物時，mt1d-m1p表達盒串聯體的定點插入使初始菌株的蔗糖到甘露醇的轉化率提高很多。多基因敲除菌株中定點插入mt1d-m1p表達盒串聯體又提高產量。雙拷貝插入mt1d-m1p表達盒的菌株比單拷貝插入菌株提高產量。總之，增加甘露醇的合成途徑是增產的手段之一。