基于美拉德反應的低溫化學標記法

涂桂飛，羅惠，陳瑩瑩，胡蕾琪，欒東磊*

1(上海海洋大學，食品熱加工工程技術中心，上海，201306) 2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

隨著現代社會人們生活節奏的加快，便捷食品受到了廣大消費者的青睞，而家用微波爐因加熱速度快、熱效率高等優點被廣泛應用于需二次加熱的便捷食品中[1]。但是微波爐內的電場分布差異導致了加熱不均勻的問題[2-3]，為了研究微波對便捷食品加熱的均勻性，急需找到一種有效方式來確定微波加熱后整體溫度分布。傳統研究中只能利用紅外熱像儀觀察食品表面溫度，或利用熱電偶測量內部有限個數的溫度值，而無法得到完整的溫度分布，基于美拉德反應的化學標記法被用以分析微波熱處理后食品的溫度分布[4-7]，其原理是還原糖和氨基酸反應生成棕色物質。溫度越高，加熱時間越長，含該類反應底物的模擬食品顏色越深，因此微波加熱后可通過顏色的深淺程度獲得熱形及冷熱點。此前PANDIT等[8]使用土豆泥確定微波高溫滅菌(121 ℃)過程中食品的冷點位置；BORNAORET等[4,7]探究了90 ℃條件下結冷膠、土豆泥、蛋白凝膠的顏色變化規律，建立了顏色值與滅菌時間的關系，為微波巴氏殺菌奠定了基礎；ZHANG等[9-11]利用結冷膠、蛋白凝膠分析微波巴氏殺菌的溫度分布。以上研究表明化學標記法在微波加熱食品的溫度分布研究中起到了重要作用，但是這些研究均為微波殺菌中的應用，其反應在較高溫度下進行，而在微波對便捷食品加熱均勻性研究中，便捷食品復熱的目標溫度通常為65～70 ℃[12]，因此分析其內部溫度分布需要低溫化學標記法的支持。

本研究以D-核糖和L-賴氨酸為主要原料進行美拉德反應，首先研究了溶液中影響反應速率的因素，獲得最優的反應速率條件，將其應用于作為化學標記法載體的模擬食品，并探究其在不同溫度下的顯色反應。最后對模擬食品進行微波加熱，分析其顯色效果，以期為微波低溫復熱便捷食品的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

結冷膠，美國唐瑞斯食品物料公司；D-核糖、L-賴氨酸，北京百靈威科技有限公司；NaOH、HCl、CaCl2、FeCl3等，均為分析純。

1.2 儀器與設備

B11-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；25UG26威力微波爐，中山東菱威力電器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，金壇市城西富威實驗儀器廠；3nh-ys3060分光測色儀，深圳市三恩時科技有限公司；FE 20實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Jumbo 35真空包裝機，verbeelen Smart way酒店用品商貿有限公司；TA.XT Plus型物性質構儀，英國Stable Micro System公司；Thermo Evolution 201型紫外、可見光分光光度計，賽默飛世爾科技公司；PICOVACQ/1TC型無線溫度傳感器，安聯國際有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1D-核糖和L-賴氨酸體系模型反應

已有文獻表明，當pH<7時，美拉德反應不明顯[13]，因此本試驗只探究堿性條件下pH對核糖-賴氨酸反應體系的影響。參照文獻[14]中的方法。稱取1 g核糖和1 g賴氨酸加入98 g水中，制備6份備用，分別調節溶液pH值至7、8、9、10、11、12，并分別在55、65、75℃水浴下加熱20 min，然后放入冰水中冷卻，冷卻后使用紫外、可見光分光光度計在200～800 nm測量吸光度。

稱取1 g核糖和1 g賴氨酸加入98 g水中，調節溶液pH值至12，將pH=12的核糖-賴氨酸溶液分別在55、65、75℃水浴下反應10、20、30、40、50、60 min，冷卻后使用紫外、可見光分光光度計在200～800 nm測量吸光度。

配制0.002、0.004、0.006、0.008 mmol/L的FeCl3溶液，稱取1 g核糖、1 g賴氨酸和10 g FeCl3溶液加入88 g水中(1%質量分數組)，稱取2 g核糖、2 g賴氨酸和10 g FeCl3溶液加入86 g水中(2%質量分數組)，調節溶液pH值至12，在55℃水浴下反應20 min， 冷卻后使用紫外、可見光分光光度計在200～800 nm測量吸光度。

1.3.2 模擬食品結冷膠凝膠的制備

根據已有研究[4-8]，為了消除透明對顏色測量時的影響，本實驗加入牛奶使透明的模擬食品結冷膠變成乳白色。具體操作步驟如下：將質量分數為1%的結冷膠粉溶于水中，加熱至90℃左右，加入一定量的CaCl2，至CaCl2溶解，30 s后停止加熱，待溶液溫度降低，加入一定量的核糖、賴氨酸和牛奶，攪拌均勻，根據需求調節溶液pH，倒入容器中，冷卻形成模擬食品結冷膠凝膠。

1.3.3 模擬食品結冷膠凝膠顏色的測定

按照1.3.2的方法制備餅形(直徑×高度，85 mm×4 mm)模擬食品備用，將模擬食品放入包裝袋中抽真空處理，加熱后放入冰水中冷卻。將分光測色儀通過黑板、白板校正，使用分光測色儀測量不同加熱時間下的凝膠與未加熱凝膠的L、a、b值，其中L表示亮暗；a表示紅綠；b表示黃藍，測量3次取平均值，得到色差ΔE[15]如公式(1)所示。

(1)

1.3.4 模擬食品結冷膠凝膠持水能力的測定

按照1.3.2的方法制備結冷膠凝膠，倒入30 mL針管中，待凝結后，將樣品推出，并切成底面直徑24 mm、 高度10 mm的圓柱形。參照文獻[16]的方法，把樣品加入離心管中，探究不同含量的CaCl2對結冷膠凝膠持水能力的影響，測定條件為2 000 r/min，離心10 min，每種配比的樣品重復試驗3次。結果取平均值，根據公式(2)計算持水能力。

(2)

式中:m0是空離心管的質量；m1是離心前凝膠和離心管的總質量；m2是離心后除去水分凝膠和離心管的總質量。

1.3.5 模擬食品結冷膠凝膠強度的測定

制作底面直徑40 mm、高度25 mm的圓柱形凝膠，參照文獻[17]的方法，探頭選擇P0.5，以1 mm/s的速度移動使凝膠載體達到40%的形變，其中觸發力為5 g，凝膠強度用曲線上的最大值表示。每種配比的樣品重復試驗5次，結果取平均值。

1.4 數據分析

采用Excel 2010軟件和SPSS 19.0對數據進行統計處理和顯著性分析，當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 pH值與溫度對D-核糖和L-賴氨酸反應體系的影響

圖1-A～圖1-C為55、65、75 ℃下，不同pH值的D-核糖和L-賴氨酸溶液加熱20 min時的紫外可見光吸收光譜圖，圖1-D為在55、65、75℃下，308 nm處吸光度隨pH值變化曲線。由圖1-A～圖1-C可知，熱處理后D-核糖和L-賴氨酸溶液的最大吸收峰集中在308 nm附近，說明生成產物主要為中、小分子[18-19]。由圖1-D可知，當反應體系的pH值為7～9時，吸光度較低且變化緩慢，此時D-核糖和L-賴氨酸反應不明顯；當pH值>9時，D-核糖和L-賴氨酸溶液吸光度值上升較快，在pH值=12時達到最大值，這說明隨著pH值的增加，D-核糖和L-賴氨酸的反應速率逐漸增加且在pH值為12時達到最大值。這與吳惠玲等[13]研究的pH對葡萄糖-賴氨酸體系的結果和AJANDOUZ等[20]研究的pH對果糖-賴氨酸體系的結果類似，原因是在堿性條件下，由于鄰近N原子的影響，糖堿基C1上電子密度增大，經2,3-烯醇化反應，經過脫氨后生成還原酮類和二羰基化合物。由于還原酮類化學性質活潑，可進一步脫水再與胺類縮合，或者還原酮類本身發生裂解成形較小分子，如二乙酰、乙酸、丙酮醛等，因此，堿性環境有利于美拉德反應的進行。由吸光度隨pH值變化曲線可得，在55 ℃ 下pH=12的吸光度是pH=7時吸光度的24倍，65 ℃下pH=12的吸光度是pH=7時的140倍，75 ℃ 下pH=12的吸光度是pH=7時的190倍，隨著溫度的升高，pH值對反應促進效果得到放大，說明二者具有協同作用。

A、B、C-55、65、75 ℃下不同pH的溶液加熱20 min的紫外可見光吸收光譜圖；D-308 nm處吸光度隨pH值變化曲線圖1 pH值與溫度對D-核糖和L-賴氨酸反應體系的影響Fig.1 Effect of pH and temperature on the reaction system of D-ribose and L-lysine

2.2 溫度與時間對D-核糖和L-賴氨酸反應體系的影響

圖2-A～圖2-C為pH=12的D-核糖和L-賴氨酸溶液，在55、65、75 ℃下加熱不同時間的紫外可見光吸收光譜圖，圖2-D為pH=12的D-核糖和L-賴氨酸溶液在308 nm處加熱不同時間的吸光度。由圖2-A～圖2-C可知，D-核糖和L-賴氨酸反應體系分別加熱10、20、30、40、50、60 min后的最大吸收峰都集中在308 nm附近，而隨著加熱時間的增加，308 nm處的吸光度逐漸增加，說明核糖和賴氨酸反應產物逐漸增多。由圖2-D可得，在75 ℃下加熱10 min的吸光度相當于在65 ℃下加熱30 min的吸光度，超出了在55 ℃ 下加熱60 min的吸光度，這說明溫度是加快核糖-賴氨酸體系反應的重要因素，與鄭曉杰等[21]研究的溫度對雞骨酶解液美拉德反應的影響一致。而隨著加熱時間的增加，75與55 ℃、65與55 ℃、75與65 ℃ 的吸光度倍率差值逐漸減小，這是由于初始加熱時，溫度較高的反應速率較快，生成產物較多，而反應底物的量是一定的，隨著熱處理時間的增加，不同溫度之間產物量的差距減小。因此，要使含有D-核糖和L-賴氨酸的模擬食品在低溫下較快顯色需從其他方面考慮。

2.3 Fe3+與反應底物濃度對D-核糖和L-賴氨酸反應體系的影響

由于本實驗要使模擬食品在低溫下較快顯色，因此在研究了溫度、加熱時間、pH值外，還分析了底物濃度和金屬Fe3+對反應體系的影響。圖3為pH=12的D-核糖和L-賴氨酸溶液在55 ℃下加熱20 min后，不同Fe3+濃度和底物濃度對吸光度的影響。由圖3-A可知，隨著Fe3+濃度的升高，1%(質量分數)核糖和1%(質量分數)賴氨酸組和2%(質量分數)核糖和2%(質量分數)賴氨酸組在308 nm處的吸光度先增加后降低，在0.004 mmol/L時達到最大值。這說明Fe3+可以影響D-核糖和L-賴氨酸的反應速率，隨著Fe3+濃度的提高，兩者反應速率出現先增加后降低的趨勢，最適濃度出現在0.004 mmol/L。由圖3-B可知，熱處理條件相同時，溶液(pH=12)含有2%核糖、2%賴氨酸、0.004 mmol/LFe3+反應速度最快，這是由于增加反應底物濃度、添加0.004 mmol/L的Fe3+都能加快美拉德反應速率。這與吳惠玲等[13]關于金屬Fe3+能促進美拉德反應和BORNHORET等[7]關于增加反應底物濃度能促進美拉德反應的研究結果類似，原因可能是Fe3+通過形成絡合物來促進薛夫堿(Schiff)的形成，從而加快了D-核糖和L-賴氨酸的反應速率。隨著反應物濃度的提高，反應物與反應物之間分子發生碰撞的幾率增高，所以反應速率加快。

A、B、C-55、65、75 ℃下pH=12的溶液加熱不同時間的紫外可見光吸收光譜圖；D-308nm處吸光度隨加熱時間變化曲線圖2 溫度與時間對D-核糖和L-賴氨酸反應體系的影響Fig.2 Effect of temperature and time on the reaction system of D-ribose and L-lysine

A-308 nm處不同底物濃度溶液的吸光度隨Fe3+濃度的變化曲線；B-不同Fe3+和底物濃度的溶液紫外可見光吸收光譜圖圖3 Fe3+濃度與反應底物濃度對D-核糖和L-賴氨酸反應體系的影響Fig.3 Effect of Fe3+ Concentration and substrate concentration on D-Ribose and L-Lysine reaction system

2.4 CaCl2質量分數對模擬食品結冷膠持水能力、凝膠強度的影響

已有研究表明，結冷膠的凝膠強度和持水能力越大，越能保證樣品形狀穩定[4-5]。將含有結冷膠粉的溶液制作成凝膠固體時，CaCl2濃度對其成型影響較大，因此考察了不同CaCl2含量對凝膠的影響。圖4-A和圖4-B為當膠粉含量為1%(質量分數)時，不同CaCl2含量對結冷膠持水能力和凝膠強度的影響。

A-凝膠強度隨CaCl2含量的變化曲線；B-持水能力隨CaCl2含量的變化曲線圖4 不同CaCl2含量對模擬食品結冷膠凝膠強度和持水能力的影響Fig.4 Effect of different content of calcium chloride on gel strength and water holding capacity of model food gel

由圖4可知，隨著CaCl2含量的增加，結冷膠的持水能力和凝膠強度呈先增加后降低。當CaCl2含量為0.07%(質量分數)時，結冷膠的持水能力和凝膠強度最大，分別為96%和3 146 g。這與HUANG等[22]研究的結冷膠凝膠性質隨金屬離子變化趨勢和邵瑤瑤等[23]研究的蛋白凝膠隨金屬離子變化趨勢類似，原因是結冷膠分子的羧基側鏈在靜電作用下出現互相排斥，這阻礙了螺旋的緊密聚集，而陽離子的介入能屏蔽靜電排斥作用，一個陽離子連接一對羧基，因此當加入Ca2+時，結冷膠的持水能力、凝膠強度也隨之提高；但過多的陽離子又會阻礙結冷膠雙螺旋結構的有序聚集，減弱凝膠，所以當離子濃度超過一定限度，又會造成結冷膠持水能力、凝膠強度下降[24]。因此本實驗使用0.07%(質量分數)CaCl2來制作結冷膠凝膠，滿足對結冷膠凝膠進行切片處理以分析整體溫度分布的需求。

2.5 結冷膠的顏色變化

將制作模擬食品溶液的pH調為12并添加0.004 mmol/L Fe3+(實驗組)與不對制作模擬食品的溶液處理(對照組)加熱不同時間進行對比，由圖5可知，pH=9的組別(對照組)在不同溫度下加熱不同時間后，結冷膠顏色由白色變為黃色，pH=12的組別(實驗組)則由淡黃色變為黃紅色，并隨著加熱時間的增加，結冷膠顏色最終變為黑紅色，與對照組相比，實驗組美拉德反應程度更深。

圖5 模擬食品結冷膠顏色隨時間變化圖Fig.5 Chart of colour change of model food gel with time

圖6為不同組別模擬食品的色差隨加熱時間的變化規律。由圖6可知，隨著加熱時間的增加，結冷膠的色差ΔE逐漸增大，這是由于反應產物逐步增多，這與項惠丹等[25]研究的酪蛋白與還原糖反應和王博等[26]研究的酪蛋白酸鈉與還原糖類反應一致。在pH=9的組別(對照組)中，相同熱處理時間下，溫度越高，色差ΔE越大，說明升高溫度能加快D-核糖和L-賴氨酸的反應速率，這與液體體系中得到的結論相符。

圖6 結冷膠的色差ΔE隨加熱時間的變化規律Fig.6 Variation of ΔEvalue of model food gel with heating time

當溶液(pH=12)含有1%D-核糖、1%(質量分數)L-賴氨酸、0.004 mmol/L Fe3+時，制成的結冷膠在55 ℃下加熱10 min的色差相當于65 ℃1%組加熱50 min的色差以及75 ℃1%組加熱30 min的色差，說明將制作溶液pH調至12、添加Fe3+制成的模擬食品顏色變化速度極大加快，在pH=12含有Fe3+的反應體系中，2%組結冷膠色差顯著高于1%組色差(P<0.05)，因此當溶液(pH=12)含有2%D-核糖、2%L-賴氨酸、0.004 mmol/L Fe3+時，制成的結冷膠顏色變化最快。

2.6 模擬食品結冷膠在微波熱處理下實驗驗證

將由2%D-核糖、2%L-賴氨酸、0.004 mmol/L Fe3+、pH=12的溶液制成的模擬食品結冷膠(直徑×高度：14 cm×2 cm)放入700 W微波爐中加熱90 s，得到加熱后模擬食品的溫度分布及冷熱點，準備一個相同的樣品，在已知冷熱點位置分別插入2個無線溫度傳感器如圖7-A所示，其中一個溫度傳感器探頭插入熱點位置a，另一個探頭插入冷點位置b，放入微波爐內相同位置加熱90 s，將加熱后的中部切面圖經MATLAB軟件處理轉換成偽彩圖，增強圖片顏色對比度來更清晰地顯示熱形；圖7-B為90 s內冷熱點的溫度曲線，熱點位置a在加熱后由12 ℃升至59 ℃，并變為暗黑色，美拉德反應程度較高，而冷點位置b由12 ℃升至39 ℃，仍為淡黃色，美拉德反應程度低。便捷食品復熱的目標溫度通常為65～70 ℃，而本實驗中結冷膠能在微波爐內90 s加熱到60 ℃左右顯色，因此在微波對便捷食品加熱均勻性研究中，可以使用該模擬食品分析其內部溫度分布。

A-溫度分布圖; B-冷熱點分布圖圖7 微波熱處理后溫度分布圖及冷熱點溫度曲線Fig.7 Temperature distribution after microwave heating and cold hot spot temperature curve

3 結論

在D-核糖和L-賴氨酸液體反應體系中，生成產物的吸收峰集中在308 nm附近，當pH值在7～12時，美拉德的反應速率隨著pH的升高而增加；隨著溫度的升高，pH值對反應促進效果被溫度放大，說明二者具有協同作用；此外，Fe3+也可以影響D-核糖和L-賴氨酸的反應速率，隨著Fe3+濃度的升高，兩者反應速率出現先增加后降低的趨勢，最適濃度為0.004 mmol/L。在制作模擬食品結冷膠時，當膠粉含量為1%(質量分數)、CaCl2含量為0.07%(質量分數)時，制作的結冷膠凝膠強度和持水能力最高，凝膠質地堅硬，能在加熱后切片進行熱形分析；在相同熱處理條件下，當溶液(pH=12)含有2%D-核糖、2%L-賴氨酸、0.004 mmol/L Fe3+時，制成的結冷膠顏色變化速度最快，在微波爐中加熱90 s由12至60 ℃左右能顯色，因此在微波對便捷食品加熱均勻性研究中，可以使用該模擬食品分析其整體溫度分布，本試驗為微波低溫復熱便捷食品的研究提供了一定的基礎。