植物乳桿菌亞硝酸鹽還原酶基因在大腸桿菌中 重組表達、純化及酶學性質分析

張慶芳,李美玉,王曉輝,胡善松,于爽,遲乃玉*

1(大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連，116622) 2(遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連，116622)

圖1 CuNiR中亞硝酸鹽還原的作用機理Fig.1 The mechanism of action of nitrite reduction in CuNiR

隨后，水復合材料能夠重新進入催化體系并發揮其在亞硝酸鹽還原中的作用[7]。HORRELL等[8]研究了CuNiR分子與結構特征，但未報道CuNiR酶學性質的研究。本研究在酸菜湯汁中分離得到1株植物乳桿菌(Lactobacillussp.)，命名為LMY-20。合成了LMY-20菌株的nir基因，并對其蛋白進行了表達純化及酶活性質研究，重組NiR溫度穩定性較好，為亞硝酸鹽還原酶基因的進一步開發及利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(Lactobacillussp. LMY-20)從東北酸菜湯汁中分離篩選得到，保藏于大連大學生命科學與技術學院遼寧省海洋微生物工程實驗室；表達載體pET28a(+)和E.coliDH5α由Synbio Technologies提供；E.coliBL21(DE3)、pMD-19-T Vector、PowerMaxTM Soil DNA Isolation Kit基因組大量提取試劑盒購自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、限制性內切酶NcoI和XhoI、2xTaq PCR Master-Mix，購自北京TIANGEN生物公司；預染蛋白分子質量標準(PageRuler Prestained Protein Ladder)，購自MBI Fermentas公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自上海生工。其他試劑為分析純。

1.2 培養基

MRS培養基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨10、酵母粉4、K2HPO42、牛肉粉8、MgSO40.2、乙酸鈉5、檸檬酸三銨2、MnSO40.05、吐溫-80 1、瓊脂20、pH(6.2±0.2)。

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸提物5、NaCl 10。LA培養基：LB液體或固體培養基中加入終質量濃度為100 μg/mL卡那霉素。

1.3 實驗設備

Veriti Dx PCR擴增儀，Thermo Fisher Scientific公司；GS-158低溫臺式離心機，BECKMAN公司；J21-M高速冷凍離心機，BECKMAN公司；臺式冷凍離心機，Eppendorf公司；CH1015超級恒溫水浴槽，上海恒平儀器廠；Inazge Mlaster RVDS電泳成像系統，Parmacia Biotech公司；DYY-Ⅲ形電泳槽，北京六一儀器廠；Milli-QAcademic超純水器、pH計，BECKMAN公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 目的基因的獲取與合成

Lactobacillussp. LMY-20于MRS培養基30 ℃，160 r/min振蕩培養36 h后離心富集菌體，利用基因組大量提取試劑盒提取基因組DNA。所提DNA送到北京百邁克生物科技有限公司進行DNA質量檢測，并使用Illumina Hiseq X10高通量測序平臺進行雙端測序(PE150)，建庫大小為270 bp。對測序數據過濾低質量后，利用Velvet軟件[9]進行初步組裝得到最終基因組框架圖。組裝得到基因組序列總長度為3.27 Mb，GC含量為44.36%，測序深度為180×。基因預測與功能注釋由RAST(rapid annotation using subsystem technology)[10]完成，選取默認參數。亞硝酸鹽還原酶基因的獲取由基因功能注釋結果及BLAST比對NiR參考蛋白序列(ERL45402.1，AHN70577.1，ATO54837.1，AFO84709.1，GAF39669.1，WP_094784585.1，PNE49716.1，PNE49716.1，WP_005922732.1，EAV38847.1，CUW15443.1，OEG23520.1，OJG98603.1)確定，由Synbio Technologies公司對菌株LMY-20的nir基因進行基因全長合成并構建于克隆載體pMD-19-T。

1.4.2 重組表達載體pET28a-nir的構建

以pMD-19-T-nir為模板，nir-F：5-CTCGAGAAAA GACCATGGCCAA-3和nir-R：5-CTTAAGAATCCTGT TTGGAC-3為引物， PCR擴增nir基因。PCR反應條件：94 ℃變性5 min。循環參數為：94 ℃、30 s，65 ℃、45 s(即退火時每圈減少2 ℃)，72 ℃、 1 min、5個循環。循環參數為：94 ℃、30 s，55 ℃、 45 s，72 ℃、1 min，72 ℃、 10 s，25個循環，PCR反應結束。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定純度和分子質量的大小?；厥誔CR產物，將獲得的片段經NcoI和XhoI雙酶切后亞克隆至pET28a(+)載體的NcoI和XhoI位點之間，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，轉化子經菌落PCR鑒定篩選出符合要求的陽性克隆，對陽性克隆進行測序NcoI和XhoI雙酶切驗證，將構建正確的重組質粒命名為pET28a(+)-nir。

1.4.3nir基因的表達

將構建好的表達菌株接種到LB/Kan液體培養基中，37 ℃振蕩過夜培養14 h，然后分別按1%的菌液量接種于含有100 mL LB/Kan液體培養基的三角瓶中，37 ℃振蕩培養4 h (菌液OD600達到0.4～0.6) 時[11]，加入異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)使最終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導時間4 h行誘導表達；同時以空載體和未誘導作對照。將菌液8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀菌體用PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌2次，將洗滌后的菌體重懸于10 mL預冷的PBS緩沖液(pH 7.4) 中，超聲裂解10 min，每次3 s，間隔5 s，功率200 W。然后10 000 r/min，4 ℃，離心20 min。分別上清液、沉淀為蛋白樣品經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 檢測，記錄并分析結果。

1.4.4 NiR蛋白包涵體的變性溶解與純化

上述沉淀物用20 mL包涵體洗滌液(2 mol/L尿素，1‰ 曲拉通X-100(體積分數)，1‰ 十二烷基肌氨酸鈉(體積分數)，1 mmol/L DTT，20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl)在4 ℃條件下洗滌3次，置8 000 r/min離心20 min；洗滌后的沉淀用10 mL蛋白質變性液(6 mol/L 尿素，1 mmol/L DTT，1%(體積分數)十二烷基肌氨酸鈉)重懸包涵體，8 000 r/min離心30 min，棄掉沉淀；將上述變形后的蛋白液用復性液(20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，0.1%(體積分數)曲拉通X-100， 20%(體積分數)甘油)4 ℃攪拌透析24 h后，逐漸換到終體積分數為10%甘油，4 ℃攪拌透析24 h。 透析袋中的目的蛋白包涵體經變性溶解后為粗酶液[12-13]。粗蛋白Ni+-NTA親和層析柱(Novagen)進行親和層析純化[14]，洗脫蛋白液4 ℃保存，蛋白樣品經SDS-PAGE檢測，記錄并分析結果。

1.4.5 蛋白質濃度測定

蛋白濃度通過Bradford蛋白濃度測定試劑盒(bradford protein assay kit) 測定。

1.4.6 NiR酶活性的測定[15-16]

測定酶活反應體系(500 μL)(μL)：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.5) 50，0.1 mol/L NaNO225，0.1 mol/L MV 15，0.1 mol/L Na2S2O480，酶液300。37 ℃水浴中反應10 min，劇烈振蕩終止反應(以磷酸緩沖液為空白)。取10 μL用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽殘留量。亞硝酸還原酶活力單位通過在37 ℃ 下，每分鐘還原1 μmol亞硝酸鹽所消耗的酶量來表示。比活力用1 mg蛋白質中酶的活力單位數來表示。

1.4.7 重組NiR的性質分析

最適反應溫度：在pH 6.5的PBS緩沖溶液條件下，在4、10、20、25、30、35、37、40、50、60、70 ℃下測定酶活，以37 ℃的酶活為100%計算相對酶活。

酶的熱穩定性：將酶液分別置于不同溫度(4、10、20、25、30、35、37、40、50、60、70 ℃)下水浴40 min，在pH6.5的PBS緩沖溶液中和最適反應溫度下檢測殘余酶活，并以未保溫時的酶活為100%計算相對酶活。

最適反應pH值：在最適酶活反應溫度下，分別用0.25 mol/L、pH 2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；0.25 mol/L、pH 6.5、7.0、 7.5、8.0的Tris-HCl緩沖液；分別用0.25 mol/L、pH 9.0、10.0、11.0的Na2HPO4-NaOH緩沖液中測定酶活，以pH 6.5的酶活為100%計算相對酶活，繪制酶活曲線。

酶的pH值穩定性：將酶液分別置于上述緩沖液中水浴40 min，在最適反應pH值和最適反應溫度下檢測殘余酶活，并以未保溫時的酶活為100%計算相對活性，繪制酶活曲線。

金屬離子及EDTA對酶活性的影響：分別向反應體系中加入終濃度為1、5 mmol/L的Zn2+, Cu2+, Ba2+, Na+, Fe3+, Mg2+, Al3+, Mn2+及EDTA，在標準條件下測定酶活，并和不添加任何金屬離子的酶活進行比較，計算相對活性，每次做3組平行實驗。

1.4.8 動力學分析

在標準條件下，分別測定0.01～0.1 mol/L NaNO2存在條件下NiR的動力學參數。以Origin 8.0 對數據進行擬合，推算酶催化的Km及Vmax，依據測定蛋白含量，計算kcat及催化效率(kcat/Km)，所有測定設置3個平行。

2 結果與分析

2.1 目的基因PCR擴增產物的鑒定

以質粒pMD-19-T-nir為模板，用引物nir-F和nir-R PCR擴增nir基因，PCR產物經1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳，可見約1.3 kb的特異性條帶(圖2)，大小與預期相符(1.262 kb)。

1～5-nir基因的PCR產物；M-DNA marker DL2000圖2 亞硝酸鹽還原酶基因PCR產物Fig.2 Electrophoretic profile of the PCR product of nir

2.2 重組表達載體pET28a(+)-nir的鑒定

重組表達載體pET28a(+)-nir經NcoI和XhoI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約5.4 kb的載體片段和1.3 kb的目的基因片段(圖3)。對重組表達載體pET28a(+)-nir進行DNA測序，結果顯示插入基因序列與設計序列完全一致，成功構建了重組表達載體pET28a(+)-nir。

M-DNA marker DL5000；1-pET28a(+)-nir的酶切產物；2-未酶切的pET28a(+)-nir圖3 重組表達質粒pET28a(+)-nir的酶切鑒定Fig.3 Identification of the pET28a(+)-nir plasmid digested with NcoI and XhoI

2.3 NiR目的蛋白誘導表達

將經鑒定正確的原核重組表達質粒載體pET28a(+)-nir轉化至表達宿主菌E.coliBL21(DE3)中誘導表達。菌體裂解物進行SDS-PAGE電泳，由圖4可知，泳道空載、未誘導宿主菌株和誘導菌株的破碎上清液均未見目的蛋白，而誘導菌株的破碎沉淀泳道約45 kDa位置處出現特異條帶，與預期表達的相對分子質量(44.959 kDa)相符，說明目的蛋白NiR在宿主菌E.coliBL21(DE3)中成功表達，但只在沉淀中檢測到目的蛋白，由此可知，目的蛋白NiR在大腸桿菌中以包涵體形式不可溶表達。

1-誘導pET28a(+)-nir/BL21(DE3)沉淀；2-誘導pET28a(+)-nir/BL21(DE3)上清；3-未誘導pET28a(+)-nir /BL21(DE3) 沉淀；4-未誘導pET28a(+)-nir /BL21(DE3) 上清；M-蛋白質marker圖4 目的蛋白NiR的SDS-PAGE檢測結果Fig.4 SDS-PAGE analysis of NiR protein

2.4 包涵體復性與Ni+-IDA親和純化

在低溫條件下，將離心所得的包涵體先用緩沖液洗滌，除去包涵體表面雜質，再對包涵體進行溶解，收集上清液。經透析復性，去除高濃度尿素，逐漸恢復重組蛋白空間構象，復性后的蛋白為粗酶液，其NiR酶活為33.97 U/mg。

蛋白復性液通過Ni+-NTA親和層析法純化重組NiR(圖5)。純化NiR總蛋白含量為10.3 mg，比活力為226.48 U/mg，總活力為2 332.72 U，總回收率為63.00%，純化倍數為7.32(表1)。

表1 重組NiR的純化Table 1 Summary of NiR enzyme

M-蛋白質marker；1～4-Ni2+柱的80、100、150、300 mmol/L咪唑溶液洗脫液圖5 純化產物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE profile of purified NiR

2.5 酶學性質研究

2.5.1 pH對酶活性的影響

由圖6-a可知，重組NiR相對酶活在pH 2.0～12.0先升高后降低，在pH為6.5時達到最大值，之后相對酶活逐漸降低，因此，重組NiR的最適pH值為6.5。在37 ℃條件下，分別采用不同pH值的PBS緩沖液孵育重組NiR，結果表明，該酶在pH 6.5～8.0的穩定性較好，相對酶活保持在60%以上。其中，在pH為7.0時最穩定(圖6-b)。

a-最適pH; b-酶的pH穩定性圖6 pH和酶的pH穩定性對重組NiR酶活力的影響Fig.6 Effect of reaction pH and pH stability of the enzyme on NiR enzymes activity

2.5.2 溫度對酶活性的影響

由圖7-a可知，重組NiR最適溫度為37 ℃，在25～40 ℃時具有85%以上的相對酶活。在pH 6.5條件下，分別在不同溫度下孵育重組NiR，結果表明，該酶在4～40 ℃的溫度穩定性較好，相對酶活保持在65%以上(圖7-b)，具有廣泛的溫度適應性。

a-最適溫度；b-酶的熱穩定性圖7 溫度和酶的熱穩定性對重組NiR酶活力的影響Fig.7 Temperature and thermal stability of the enzyme on NiR enzymes activity

2.5.3 金屬離子及EDTA對酶活性的影響

Fe3+、Cu2+和Na+對重組NiR有促進作用，其中Na+促進作用明顯； Mg2+、Mn2+和Zn2+對該酶的酶活力有輕微抑制作用，該酶的酶活力被Al3+、EDTA和苯甲基磺酰氧(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)強烈抑制(表2)。

2.6 動力學分析

在標準方法和條件下，在pH 6.5和37 ℃下研究NiR動力學參數Km和Kcat。Km和Kcat的值分別為0.38 mmol/L和0.27×103s-1(圖8)。NiR的催化效率可以用kcat/Km計算，計算值為1.4×106mmol/(L·s)。

表2 金屬離子及EDTA對酶活性的影響Table 2 Effects of various reagents on the activity of NiR

注：數值為平均值±SD。

圖8 在pH 6.5和37 ℃下NiR降解NaNO2的動力學Fig.8 Kinetics of NiR degradation of nitrite at pH 6.5 and 37 ℃

3 討論

亞硝酸鹽還原酶大多數為胞內酶，受分離純化技術的影響，該酶的應用受到了極大限制[17]。E.coli表達系統具有成本低、繁殖快、表達量高、遺傳背景研究深入清楚以及有大量可利用的表達載體、宿主和純化系統等優點，成為目前應用最廣的表達體系[18-19]。但由于宿主蛋白的異源表達可能缺乏某些蛋白質折疊所需的輔助因子或調節蛋白折疊機制及環境不適等，使次級鍵在折疊過程中較難正確形成，易形成失去原有蛋白質特性和功能的包涵體[20-21]。本研究采用超聲波冰浴破壁法裂解細菌，細胞破壁效果較好，用洗滌液洗滌包涵體，經變性液溶解變性，再經復性液復性，最后用鎳親和層析法得到了濃度和純度較高的目的蛋白。

本實驗中我們選擇了帶有NcoI酶切位點的表達載體pET-28a，該表達載體多克隆位點C端有一個能編碼6個組氨酸的融合標簽His-Tag，6×His通常不影響表達產物的生物學活性，因而不必通過酶水解獲得目的蛋白，使表達的整個過程更為簡單，同時該融合標簽可用于目的蛋白的檢測和純化。在融合標簽His-Tag后還相連一個終止密碼子TGA，它保證了目的蛋白和His-Tag的完整表達[22-24]。截至目前，文獻報道亞硝酸鹽還原酶主要集中于甜菜、小麥、菠菜等植物中[17, 25]，而微生物亞硝酸鹽還原酶報道較少[26]。本研究成功將亞硝酸鹽還原酶基因連接至原核表達載體pET-28a上，然后將重組載體pET-28a-nir轉化到表達宿主E.coliBL21中，利用IPTG進行誘導表達后經SDS-PAGE檢測顯示為不可溶的包涵體表達，隨后進行包涵體復性及鎳柱親和層析純化蛋白，并研究了重組NiR的性質。結果表明，該酶具有廣泛的溫度適應性和穩定性，為NiR的應用及工業化生產奠定基礎。