小麥內(nèi)生耐鹽菌株YN1的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

李星志 王虹 趙丹 石運幸 劉愛新

摘要：本試驗從山東無棣縣鹽堿地健康小麥莖基部分離到1株內(nèi)生細(xì)菌YN1，對其進行菌落形態(tài)觀察和16SrDNA分子鑒定，并分析其固氮能力、產(chǎn)鐵載體能力和產(chǎn)IAA能力，測定了150mmol/LNaCl脅迫下經(jīng)菌株處理后小麥的耐鹽能力。結(jié)果表明，該菌株為成團泛菌（Pantoeaagglomerans），具有固氮和產(chǎn)鐵載體能力，其在0、100mmol/LNaCl條件下IAA產(chǎn)量分別為112.06、153.81μg/mL。與CKI相比，YN1處理的小麥幼苗在150mmol/LNaCl脅迫下株高、根長等顯著增加，葉綠素、類胡蘿卜素、脯氨酸含量分別提高77.23%、78.55%、47.90%，CAT、POD和SOD活性分別提高74.7%、27.1%和64.2%，而丙二醛含量下降35.3%，表明YN1處理可提高小麥的耐鹽能力。

關(guān)鍵詞：小麥;鹽堿地;內(nèi)生細(xì)菌;成團泛菌;耐鹽能力

中圖分類號：S476.1文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）05-0063-06

我國鹽堿地面積大、分布廣泛，僅環(huán)渤海地區(qū)就有266.7萬公頃中低產(chǎn)田鹽堿地和66.7萬公頃鹽堿荒地，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)潛力巨大，是我國今后農(nóng)業(yè)科技開發(fā)的重要領(lǐng)域，也是保障國家糧食安全的重要發(fā)展區(qū)域。近年來研究人員在耐鹽品種選育方面進行了大量研究，為開發(fā)利用鹽堿地提供了可能[1，2]。

除培育抗、耐鹽品種外，利用植物內(nèi)生細(xì)菌提高其耐鹽能力也越來越受到重視。許多鹽堿地生長的植物內(nèi)生細(xì)菌本身具有耐鹽能力，對促進寄主植物生長發(fā)育、抵抗逆境等具有重要作用[3]。研究表明PGPR菌株除通過固氮、分泌鐵載體和生長素（IAA）等方式促進植物根系發(fā)育[4]，還可通過分泌信號調(diào)節(jié)物質(zhì)或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆代謝物質(zhì)等提高抗逆性[5]。張磊等[6]證實某些PGPR（plantgrowth-promotingrhizobacteria）菌株可以促進植物對鹽害的抵抗力。本研究從山東省無棣縣鹽堿地小麥健株中分離到一株耐鹽菌株YN1，對其進行生物學(xué)特性研究，并分析其對小麥耐鹽能力的影響，以期為鹽堿地開發(fā)中利用該菌株提供參考。

1材料與方法

1.1材料

2016年4月，于山東省無棣縣山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗鹽堿地小麥田采集小麥健株，用于耐鹽菌株分離。供試小麥品種為山農(nóng)22。

供試培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng);TSA培養(yǎng)基用于菌株的篩選;Hoagland半固體培養(yǎng)基用于小麥幼苗的培養(yǎng);阿貝無氮培養(yǎng)基用于檢測菌株的固氮能力;MSA培養(yǎng)基用于檢測鐵載體的產(chǎn)生。

1.2主要試劑

Salkowski試劑用于檢測IAA含量;CAS染劑用于鐵載體檢測;抗氧化酶活性測定試劑盒，購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1菌株的分離及鑒定菌株分離：將小麥植株表面消毒，剪取莖基部1g研磨，用無菌水稀釋至不同濃度，采用平板稀釋法用TSA培養(yǎng)基進行分離。

菌落形態(tài)觀察：將分離獲得的菌株于NA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色等。

分子鑒定：菌株YN1于28℃、NB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，8000r/min離心收集菌體，CTAB法提取基因組DNA。用16SrDNA通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物送上海生工測序。用DNAMAN軟件將測序結(jié)果進行拼接，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌序列進行比對，使用MAGE5.0制作進化樹，分析其所屬類別。

1.3.2菌株固氮能力測定將菌株YN1（于NB培養(yǎng)基培養(yǎng)）用無菌水稀釋至OD600=1.0，取10μL菌液滴于阿貝無氮培養(yǎng)基中央，于28℃培養(yǎng)5d后，根據(jù)透明圈的有無和大小，確定菌株的固氮能力[7]。重復(fù)3次。

1.3.3菌株產(chǎn)鐵載體能力測定參照Chen等[8]的方法。將50mLCAS試劑與等量1mol/L磷酸緩沖液混合后，加入到200mLMSA培養(yǎng)基中，制成MSA平板。將培養(yǎng)的菌株YN1用無菌水稀釋至OD600=1.0，取10μL菌液滴于MSA平板中央，28℃培養(yǎng)5d，觀察菌株周圍是否出現(xiàn)橘紅色，以無菌水為對照。重復(fù)3次。

1.3.4菌株分泌IAA能力測定參照文獻[9]的方法。菌株YN1用無菌水稀釋至108cfu/mL，以3%（V/V）的接種量接種于含有50mLNB培養(yǎng)液的三角瓶中，培養(yǎng)液中NaCl濃度分別為0mmol/L和100mmol/L;隨后向各瓶培養(yǎng)基中加入色氨酸，使瓶中色氨酸濃度達(dá)到10-4mg/L，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)3d。菌液于8000r/min離心5min，取1mL上清液與1mLSalkowski試劑混合，避光靜置30min，用紫外分光光度計于530nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IAA量。重復(fù)3次。

1.3.5菌株YN1對小麥的耐鹽能力分析參照文獻[10]的方法。小麥種子用5%次氯酸鈉表面消毒后，于25℃催芽24h。菌株YN1先用無菌水稀釋至108cfu/mL，后將催芽種子在菌液中靜止放置4h。用無菌濾紙吸干種子表面多余液體，放入裝有Hoagland半固體培養(yǎng)基的試管中，NaCl濃度為150mmol/L。于光照培養(yǎng)箱內(nèi)（晝/夜溫度為20℃/15℃，光/暗周期為16h/8h）培養(yǎng)12d后，測量小麥株高和根長，統(tǒng)計小麥地上部、根鮮重和側(cè)根數(shù)。以無菌水+150mmol/LNaCl處理為CK1，無菌水處理為CK2。

1.3.6菌株YN1處理對小麥脯氨酸、丙二醛、葉綠素含量等的影響參照文獻[11]的方法測定脯氨酸含量。采用1.3.5的方法培養(yǎng)小麥種子，取培養(yǎng)12d的小麥幼苗0.5g，按1/10（W/V）加入3%磺基水楊酸5mL，沸水浴10min，冷卻過濾。取2mL濾液加入冰醋酸和酸性茚三酮溶液各2mL，沸水浴30min，冷卻至室溫，加入4mL甲苯，振蕩器高速振蕩30s，靜置5min。取上層溶液測定520nm下吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算脯氨酸含量。

丙二醛含量測定參照文獻[12]的方法。取小麥幼苗0.5g，加入5%TCA溶液5mL，冰浴下研磨，3000×g離心15min，取2mL上清液與5mL0.5%硫代巴比妥酸溶液混勻，沸水浴10min，冷卻至室溫，3000×g離心15min。取上清液分別測定532、600、450nm下的吸光度。根據(jù)公式[6.452×（OD532-OD600）-0.559×OD450]×Vt/（FW×Vs），計算丙二醛含量。式中，Vt為提取液總體積，Vs為測定用提取液體積，F(xiàn)W為樣品鮮重。

參照文獻[13]的方法測定葉綠素和類胡蘿卜素含量。稱取小麥葉片0.5g，加入80%丙酮3mL，研磨至勻漿，16000×g離心5min，將上清液用80%丙酮定容至10mL。分別測定470、663、645nm下的吸光度，根據(jù)吸光度值分別計算類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量。以80%丙酮作為空白，以空白作為參比。重復(fù)3次。

1.3.7菌株YN1對小麥過氧化酶活性的影響參照酶活性測定試劑盒說明書制備粗酶液。稱取0.5g小麥葉片，液氮研磨，按1/10（W/V）加入酶提取液，混勻，4℃、8000r/min離心15min，上清液為粗提液。

SOD活性測定：取90μL粗酶液，根據(jù)試劑盒說明書，按比例、順序加入不同反應(yīng)液，充分混勻，室溫靜置30min，于560nm測定吸光度值。參照試劑盒提供的公式計算SOD活性。

CAT活性測定：取35μL粗酶液與CAT檢測工作液混合，室溫下立即測定240nm下初始吸光度值和1min后的吸光度值，根據(jù)試劑盒提供的公式計算CAT活性。

POD活性測定：吸取15μL粗酶液，參照試劑盒說明書按比例加入不同反應(yīng)液，混合均勻，記錄470nm下30s時的吸光度值和1min后的吸光度值，參照試劑盒提供的計算式計算POD活性。

1.4數(shù)據(jù)分析

利用MicrosoftExcel2003進行數(shù)據(jù)整理和作圖，利用DPSV3.01進行方差分析和差異比較。

2結(jié)果與分析

2.1菌株分離與鑒定

菌株YN1菌落形態(tài)特征：菌落為淡黃色，有光澤，表面光滑，粘稠、邊緣整齊，無流動性（圖1）。

用16SrDNA通用引物對菌株YN1的DNA進行PCR擴增，在1400bp左右擴增出單一條帶。之后對PCR產(chǎn)物進行序列測定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，利用MEGA5.0軟件分析系統(tǒng)進化關(guān)系。結(jié)果（圖2）顯示，菌株YN1與已報道的成團泛菌（Pantoeaagglomerans）菌株（基因登錄號HQ219999.1）親緣關(guān)系最近，相似性在99.9%，分在同一分支，確定該菌株為成團泛菌。

2.2菌株YN1生物學(xué)活性測定

對菌株YN1固氮能力、產(chǎn)鐵載體能力和產(chǎn)IAA能力進行測定發(fā)現(xiàn)，YN1分別在無氮培養(yǎng)基上和CAS-MSA平板培養(yǎng)5d后，菌株周圍分別出現(xiàn)透明圈和橘紅色暈圈，表明YN1具有固氮能力（圖3a）和產(chǎn)鐵載體能力（圖3b）。

由圖4可知，菌株YN1可以產(chǎn)生生長素（IAA），在100mmol/LNaCl條件下，IAA產(chǎn)量為153.81μg/mL，比無NaCl時增加26.79%（112.06μg/mL）。表明鹽脅迫可以提高菌株YN1的IAA產(chǎn)量。

2.3菌株YN1對小麥耐鹽能力的影響

菌株YN1處理的小麥耐鹽能力結(jié)果如圖5、表1所示。鹽脅迫（150mmol/LNaCl）下，YN1處理后的小麥幼苗株高、主根長、鮮重等均比CK1有顯著提高，其中株高和側(cè)根數(shù)分別增加92.2%和40.8%，植株鮮重增加102.4%。但與CK2相比，株高和植株鮮重明顯降低，根長、側(cè)根數(shù)明顯增加。表明YN1處理提高了小麥幼苗的耐鹽能力。

2.4菌株YN1對小麥抗逆代謝的影響

由圖6可以看出，在150mmol/LNaCl脅迫下，經(jīng)菌株YN1處理的小麥脯氨酸含量比CK1增加47.90%，葉綠素和類胡蘿卜素含量分別增加77.23%和78.55%，MDA含量下降35.3%。表明在鹽脅迫下，YN1處理增強了小麥的抗逆代謝。

2.5菌株YN1對小麥抗氧化酶活性的影響

由圖7可以看出，鹽脅迫下，與CK1相比，YN1處理的小麥植株的抗氧化酶活性均有明顯提高，CAT、POD和SOD活性分別增加74.7%、27.1%和64.2%。表明菌株YN1可能通過提高小麥植株抗氧化酶活性增強耐鹽能力。

3討論與結(jié)論

經(jīng)鑒定，本研究分離到的耐鹽菌株YN1為Pantoeaagglomerans。該菌株具有產(chǎn)鐵載體、固氮等特性，100mmol/L鹽濃度可顯著提高其產(chǎn)IAA能力。另外，該菌株可促進小麥在中度鹽濃度（150mmol/L）下生長并顯著提高小麥體內(nèi)脯氨酸、葉綠素等含量和SOD、CAT等抗氧化酶活性。

植物在鹽脅迫下主要表現(xiàn)為生長抑制。潘多鋒等[14]發(fā)現(xiàn)，偃麥草苗期株高、成活率、生物量的降低均與鹽濃度升高有關(guān)。PGPR菌株對提高植物的耐鹽能力有重要作用。許芳芳等[15]發(fā)現(xiàn)小麥內(nèi)生腸桿菌FYP1101能夠顯著提高小麥的耐鹽能力和鹽脅迫下小麥的生物量。Li等[11]也發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌Pantoea和Bacillus等在中高鹽濃度下對象草（Pennisetumpurpureum）的生長有顯著的促生作用。本研究證實菌株YN1可增加小麥在鹽脅迫下的生物量，提高小麥的耐鹽能力。

研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸、可溶性糖等代謝物和SOD、POD等抗氧化酶與植物抗逆密切相關(guān)。脯氨酸作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)外滲透壓提高植物抗逆境脅迫的能力，脯氨酸的積累可提高植物的耐鹽能力[12-17]。SOD、POD等為植物體內(nèi)主要的抗氧化酶，可清除植物體內(nèi)活性氧，緩解過多活性氧對植物的損傷[13，18]。傅蕾等[12]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌Pantoeasp.不僅提高鹽脅迫下狼尾草種子發(fā)芽力，而且明顯提高植株體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量，同時多種抗氧化酶活性也顯著提高。本研究得出菌株YN1處理不僅提高小麥植株內(nèi)脯氨酸含量和SOD等抗氧化酶活性，而且對葉綠素和類胡蘿卜素含量的提高也較為明顯。從耐鹽能力看，菌株YN1處理可使小麥在中度鹽濃度（150mmol/L）正常生長。這與已報道的菌株Kp120的耐鹽能力相當(dāng)[19]。

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