藍莓鯊烯合酶基因的克隆與表達分析

陳新 徐麗 張力思 魏海蓉 宗曉娟 王甲威 譚鉞 朱東姿 洪坡 劉慶忠

摘要：鯊烯合酶基因（SQS）在植物三萜類化合物合成途徑中起著重要作用，是上游代謝通路中的關鍵基因。本研究采用RT-PCR技術從‘喜來藍莓根中克隆得到VcSQS基因，序列全長1489bp，序列分析結果表明，其含有1242bp的開放閱讀框，編碼413個氨基酸。氨基酸同源序列分析表明，藍莓與其它物種SQS蛋白氨基酸序列相似性很高，與山茶科的茶相似性最高，達90.58%，與葡萄相似性達87.92%。熒光定量試驗結果表明，SQS基因在藍莓葉中的表達量最高，芽中的最低。

關鍵詞：藍莓;角鯊烯合酶基因;同源序列分析;熒光定量

中圖分類號：S663.9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）05-0001-06

我國藍莓的種植面積和產量逐年遞增，其鮮果多直接食用或加工成一些初級產品果汁、果醬等，缺乏對其高附加值產品的探索。研究表明，藍莓果實富含多種具有良好保健作用的功能活性物質，果內糖、酸、礦物元素、尼克酸、SOD、黃酮含量非常豐富[1];藍莓除含黃酮類物質和多酚外，還含有三萜類物質熊果酸和齊墩果酸[2]。

熊果酸（ursolicacid，UA），分子式為C30H48O3，分子量為456.68，是存在于植物中的五環三萜類化合物，具有一定的生物活性和重要的藥理作用[2-6]。已有研究證明熊果酸具有抗腫瘤、抗癌、保肝、消炎等多種功效，能夠抵抗多種致癌及促癌物。張秋萍等[7]認為熊果酸對人白血細胞K562的體外增殖有一定的抑制作用，其抑制效果與所用劑量成正比，并且能夠誘導K562細胞的凋亡。Kassi等[8]證明熊果酸可明顯抑制前列腺癌細胞PC-3和LNCaP。此外，熊果酸中含有脂羥基化學結構，抗氧化能力強，能夠清除自由基，具有美白護膚的功效，多用于化妝品添加物。由于其特殊的藥理作用，熊果酸被推崇為最具潛力的抗癌藥物之一。另有研究發現熊果酸對化學藥品引起的肝損傷擁有比齊敦果酸更好的療效[9]。因此，藍莓三萜類物質的研究對于癌癥等疾病的治療具有深遠意義。

三萜類化學物質的合成主要依賴的合成途徑是類異戊二烯代謝途徑[10]。鯊烯合酶分布于內質網，兩分子的法尼基焦磷酸在該酶的催化下，生成一分子的鯊烯[11]，而鯊烯是三萜類化合物的第一個前提物質[12]。所以，對控制鯊烯合酶合成的基因SQS的研究顯得尤其重要，有助于我們在分子水平上利用基因工程的手段實現三萜皂苷的規模化生產。

大多數植物的SQS以基因家族的形式存在，其在不同物種中除成員數量不同，表達量也存在差異[13，14]。研究者在擬南芥中發現6種SQS基因異構型，能夠編碼1～3種有功能的鯊烯合酶，另外的4～6種沒有催化活性[15];在所有組織中SQS1異構型均有表達，而SQS2不同，主要在葉脈中表達[16]。人參有3個異構型的基因，都可催化角鯊烯的合成[10];北柴胡有2個SQS基因的氨基酸同源序列相似性達到96%[17]。由此可以看出，同一物種不同異構型的SQS基因所表達的蛋白質氨基酸序列相對保守。現已克隆出多種植物的SQS基因，并在分子水平上對植物體內的三萜類物質的代謝做了深入研究。

本研究利用RT-PCR技術從藍莓中克隆到VcSQS基因，并與其它物種的SQS氨基酸序列進行同源對比，同時分析該基因在不同組織中的表達水平，以期探明鯊烯合酶在不同物種間的保守性及進化關系，并為進一步探究SQS基因表達與三萜皂苷類含量的關系奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料‘喜來藍莓根取自山東省果樹研究所泰東苗圃。取材后用液氮速凍，于-80℃保存備用。

1.2總RNA的提取及cDNA的合成

利用TaKaRaMiniBESTPlantRNA提取試劑盒提取藍莓根RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶的完整性。將提取后的RNA參照abmgood|5XAll-In-OneRTMasterMix反轉錄試劑盒說明書步驟進行反轉錄，將反轉錄得到的cDNA-20℃保存備用。

1.3VcSQS基因的克隆

根據已知其它植物SQS基因設計特異性引物（表1），以cDNA為模板，擴增目的片段VcSQS。PCR反應體系為20μL：模板0.5μL，上下游引物F、R各0.6μL，dNTP1.6μL，TaqDNAPoly-merase0.1μL，5×Buffer4μL，補水至終體積20μL。反應程序：94℃預變性3min;98℃變性10s，55℃退火5s，72℃延伸90s，35個循環;72℃延伸5min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，拍照并記錄試驗結果。使用OMEGA公司的凝膠回收試劑盒純化PCR產物，將純化得到的目的片段連接到克隆載體pTOPO-Blunt上，轉化、篩菌后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，驗證全長序列的準確性。

1.4生物信息學分析

將序列通過NCBI數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行Blast比對分析，搜索并下載其它物種的序列。利用DNAMAN軟件進行不同物種間氨基酸序列同源性分析，利用MEGA7.0構建系統進化樹。

1.5VcSQS基因組織表達特性

所用VcSQS基因qRT-PCR的引物（表1）由通用生物公司合成。利用DBI公司的SYBRGREEN進行qRT-PCR。反應體系為20μL：模板為2μL，正反向引物各0.5μL，mix10μL，ddH2O7μL。利用ABI7500熒光定量儀采用兩步法進行熒光定量PCR擴增。反應程序：95℃120s，95℃10s，60℃30s，循環40次后進行熔解曲線分析。每樣品重復3次，采用2-ΔΔct的計算方法分析相對表達量。以藍莓青果的表達量為對照。

2結果與分析

2.1VcSQScDNA的克隆分析

對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，擴增條帶大小為1500bp左右，與預期一致，可初步判斷得到VcSQS基因。使用凝膠回收試劑盒純化PCR產物，再次電泳，得到與PCR產物大小一致的條帶（圖2）。

2.2VcSQS基因的獲得及序列分析

利用RT-PCR和RACE技術從藍莓根中成功克隆VcSQS基因，序列全長為1489bp。其含有1242bp的開放閱讀框，共編碼413個氨基酸（圖3）。

2.3藍莓VcSQS的同源序列分析

利用DNAMAN軟件對推導的藍莓VcSQS氨基酸序列與其它物種進行同源性分析，結果（圖4）顯示，其與甘藍、薺藍、水稻、蓖麻的同源性在70%～80%之間;與甘藍的同源性最低，為70.79%;與另外10種植物的同源性都在80%以上，與茶的同源性達到90.58%?？傮w而言，藍莓與所參考的14種植物SQS蛋白的氨基酸序列相似性較高。

2.4藍莓VcSQS的系統進化分析

為了更加清晰地看出藍莓VcSQS與其它植物SQS之間的進化關系，利用MEGA7.0軟件，在多重比較的基礎上，將包括藍莓在內的15種植物的SQS蛋白氨基酸序列構建系統進化樹（圖5）。藍莓SQS與山茶科植物茶為一個類群，親緣關系最近，與葡萄的親緣關系也較近;與其它種屬植物的親緣關系稍遠，這與氨基酸序列同源性結果一致。這表明SQS基因具有種屬特異性。

2.5藍莓VcSQS基因在不同組織相對表達量分析

本試驗分別提取藍莓的青果、紫果、花、葉、芽、根的總RNA，反轉錄得到cDNA，進行熒光定量分析。由圖6可以看出，藍莓不同組織中VcSQS基因相對表達量的高低依次為葉、青果、根、花、紫果、芽。

3討論與結論

三萜類化合物具有良好的藥用價值和經濟價值，對其有關次生代謝產物合成的基因調控研究現已發展成為熱點領域。角鯊烯合酶SQS在三萜類化合物合成途徑中發揮重要作用，是上游代謝通路中的一個關鍵酶。目前，關于角鯊烯合酶的研究多集中于藥用植物人參、刺五加等，對藍莓的SQS研究較少。本研究以‘喜來藍莓品種為試材，從根中成功克隆VcSQS基因，序列分析表明，VcSQS基因含有1242bp的開放閱讀框，編碼413個氨基酸。氨基酸同源序列分析表明，藍莓與山茶科的茶相似性最高，達90.58%，與葡萄相似性達87.92%。系統進化樹表明藍莓SQS與山茶科植物茶親緣關系最近，為一個類群，與葡萄的親緣關系也較近，同源序列比對結果和系統進化樹得到的結論一致。熒光定量檢測結果表明，VcSQS基因在藍莓的果實、花、葉、芽、根組織器官中均有表達，葉中的表達量最高，芽中的表達量最低，青果中的表達量高于紫果。邢朝斌等[18]對刺五加角鯊烯合酶基因的研究表明SQS在葉片中的表達量要高于根。這與本研究中得出的葉中高于根中的結果一致。由此證明很有可能對于不同的物種來說葉中SQS基因表達量相對較高。但對于利用基因工程技術使SQS基因在指定組織中得到高效異源表達，進而提高三萜類物質的合成，仍需進一步探究。

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