Ras/Raf/MEK/Erk通路在慢性高原病骨髓紅系細胞中的作用及SAHA對其抑制效果的研究

馮萍珍 冀林華

(青海大學附屬醫院檢驗科，青海 西寧 810001)

慢性高原病(CMS)是一種高原環境下機體長期慢性缺氧繼發的紅細胞增多和細胞缺氧為特點的疾病。該病的病理生理機制尚不明確，有研究[1-3]認為，因機體的長期慢性缺氧誘發的低氧誘導因子(HIFs)表達的增加，可促進促紅細胞生成素(EPO)和血管內皮生長因子(VEGF)等細胞因子的表達，最終導致CMS的發生。然而，有學者[4]認為，EPO等細胞因子的上升水平與CMS發病之間缺乏有效的直接證據，這表明CMS的發病可能還有其他因素參與其中。Ras/Raf/MEK/Erk通路是真核細胞生物體內重要的信號通路之一，該通路可將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應[5-7]。目前該通路是否參與CMS發病過程尚無定論，筆者擬通過對CMS患者骨髓紅系細胞內的節點基因及蛋白的定量分析予以明確。此外，有研究[8]發現，組蛋白乙?；癄顟B對細胞的增殖存在顯著相關，組蛋白去乙酰化酶抑制劑可有效降低細胞內的組蛋白乙?；?，從而降低細胞的增殖程度。SAHA是第二代組蛋白去乙?；敢种苿哂懈叩娜ヒ阴；钚訹9]。筆者采用SAHA干預CMS患者骨髓紅系細胞，以明確其對紅系細胞過度增殖的抑制情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年12月至2017年12月我院血液科收治的明確診斷為CMS患者23例為觀察組，其中男15例，女8例，年齡31～48歲，平均(37.21±5.03)歲。另選擇同期年齡匹配的健康體檢者10名為對照組。納入標準：符合2004年版國際青海標準有關CMS的診斷標準。受試者均征得本人知情同意，本研究獲我院醫學倫理委員會批準。排除標準：原發性紅細胞增多癥；慢性肺源性心臟??；慢性阻塞性肺病；其他原因導致的慢性缺氧性疾病等。兩組受試者一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑與儀器 試劑：IMDM培養基(購自美國HyClone公司)，CD71、CD235a抗體(購自德國MiltenyiBiotec公司)，Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司)，RNA提取試劑盒(購自德國MiltenyiBiotec公司)，人Ras-GTP ELISA試劑盒(購自美國RB公司)，鼠抗人p-ERK1/2單克隆抗體(購自德國MiltenyiBiotec公司)，鼠抗人p-BRaf單克隆抗體(購自德國MiltenyiBiotec公司)，鼠抗人p-MEK單克隆抗體(購自德國MiltenyiBiotec公司)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(購自德國MiltenyiBiotec公司)，HRP標記的羊抗鼠IgG(購自江蘇碧云天公司)，引物合成(上海生工公司)。儀器：ABI 7300型實時熒光PCR儀(購自美國ABI公司)，流式細胞儀(購自美國Beckman Coulter公司)，SYSMEX XS-500i全自動五分類血球計數儀(購自日本SYSMEX公司)。

1.3方法

1.3.1骨髓有核紅細胞的采集、分離與培養 征得受試者同意后，于髂后上嵴抽取患者骨髓液10 mL，采用淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞。采用CD71及CD235a抗體磁珠分離骨髓有核紅細胞。將分選的有核紅細胞富集至1×106個/L并培養于IMDM體系中，于37 ℃、5% CO2、3% O2的低氧環境下培養72 h。將觀察組患者所培養細胞分為5組，取對數生長期細胞以2×104個/mL的密度接種于 96 孔板 ，每孔100 μL細胞懸液。SAHA 處理濃度分別為0.5、1、2、3、5 μmol/L。每一個藥物濃度設3個復孔，分別處理12、24、48 h，每個時相點結束后加0.5% MTT，4 h后加入細胞裂解液。次日于540 nm波長下讀取各孔OD值。按下列公式計算細胞生存率。細胞存活率 =(加藥組細胞 OD平均值/正常細胞 OD平均值) ×100%。

1.3.2骨髓有核紅細胞分泌Ras-GTP水平的測定 收集有核紅細胞培養液上清(800 r/min離心)，采用ELISA法繪制標準曲線并量化Ras-GTP分泌水平，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3.3骨髓有核紅細胞中BRaf、MEK、ERK1、ERK2Mrna水平的檢測 收集培養后的有核紅細胞，采用TRIZOL試劑分解細胞并提取總RNA。采用逆轉錄試劑盒合成Cdna。以β-catin為內參基因，采用ABI 7300型PCR儀將轉錄成的cDNA在50 ℃、2 min，95 ℃、15 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個循環條件下擴增。每次循環均設空白對照，計算目的基因 mRNA的相對表達量，每組重復 3 次取均值。PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析并鑒定。基因相對表達量采用△△Ct法進行計算，△△Ct=(Ct目的基因-Ctβ-catin)觀察組-(Ct目的基因-Ctβ-catin)對照組，觀察組標本相對表達量為2-△△Ct。引物序列見表1。

表1 引物序列

注：F為正義鏈；R為反義鏈。

1.3.4骨髓有核紅細胞中BRaf、MEK、ERK1、ERK2蛋白水平的檢測 采用Western blot法檢測，各組培養的有核紅細胞加細胞裂解液后取總蛋白50 μL樣本進行變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后轉移至NC膜上過夜；漂洗后，4 ℃下于NC膜上加入一抗，結合4 h；再漂洗，分別與各自二抗結合，4 ℃，2 h。結束后采用ECL顯影試劑盒顯影。預染Marker顯示蛋白質分子量，利用Quantity One軟件等高線測量法檢測，不同時點各組實驗重復3次，取平均值。

1.3.5外周血血紅蛋白(Hb)、紅細胞比容(HCT)及血氧飽和度檢測 采用SYSMEX XS-500i全自動五分類血球計數儀檢測受試者外周血Hb、HCT水平。采用指套式電傳感器檢測受試者血氧飽和度。

2 結 果

2.1兩組骨髓有核紅細胞Ras-GTP、BRafmRNA、MEK mRNA及ERK1/2 mRNA表達水平間差異 骨髓有核紅細胞Ras-GTP的表達水平采用ELISA方法檢測結果顯示，觀察組患者骨髓有核紅細胞Ras-GTP水平(22.21±4.31) pg/mL較對照組(18.35±5.08) pg/mL顯著增高(t=5.973，P<0.01)。骨髓有核紅細胞BRafmRNA、MEK mRNA及ERK1/2 mRNA表達水平采用qRT-PCR方法進行檢測，統計發現，觀察組患者骨髓有核紅細胞BRafmRNA、MEK mRNA及ERK1/2 mRNA表達水平均顯著高于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組患者骨髓有核紅細胞BRafmRNA、MEK mRNA及ERK1/2 mRNA表達水平間比較

2.2SAHA對CMS患者骨髓有核紅細胞生長的抑制作用 與未經藥物處理的CMS患者骨髓有核紅細胞相比，經不同濃度的SAHA處理后，CMS患者骨髓有核紅細胞增殖受到了明顯抑制(見圖1)；且SAHA對細胞的殺傷作用呈時間和劑量依賴性(見圖2)；而SAHA對細胞的最佳殺傷濃度為2 μmol/L，作用時間為48 h，故后續實驗采用此條件下進行。

圖2 不同時間及劑量下CMS患者骨髓有核紅細胞對SAHA敏感性實驗

2.3SAHA對CMS患者骨髓有核紅細胞信號通路蛋白表達的影響 在SAHA濃度為2 μmol/L時，細胞殺滅作用最為明顯。故采用ELISA法檢測在SAHA為該濃度下不同時點CMS患者骨髓有核紅細胞Ras-GTP濃度，結果顯示為0 h(19.03±3.36) pg/mL、12 h(18.86±4.29) pg/mL、24 h(19.29±3.64) pg/mL、48 h(19.11±2.58) pg/mL。各時點間Ras-GTP濃度未見顯著差異(F=0.339，P>0.05)。采用Western Blot法檢測BRaf、MEK及ERK1/2等蛋白表達水平，統計發現，MEK蛋白在不同時點間未見明顯差異(P>0.05)；而BRaf及ERK1/2蛋白在不同時點間存在明顯差異(P<0.05)。見表3。

表3 SAHA為2 μmol/L濃度下不同時點ERK通路相關蛋白表達水平

3 討 論

Ras/Raf/MEK/Erk信號通路是有核細胞內經典的信號通路之一，對細胞的增殖、分化、凋亡等多種生理功能均有明顯的調節作用[10]。研究結果發現，Ras/Raf/MEK/Erk信號通路中各重要節點蛋白/基因在CMS患者骨髓有核紅細胞中均顯著表達，這是因為Ras/Raf/MEK/Erk信號通路在CMS發病過程，通過三級激酶級聯反應實現異?；罨?，即上游激活蛋白激活MAPK激酶的激酶(MAPKKK)，此后繼續激活MAPK激酶(MAP-KK)，最終活化MAPK。在ERK通路中，Ras扮演上游激活蛋白的角色，Raf作為MAPKKK可激活MAPK/ERK激酶(MEK)，在此過程中，MEK相當于作為MAPKK，而ERK即MAPK[11-14]。本研究通過SAHA干預CMS患者骨髓有核紅細胞結果顯示，在2 μg/mL濃度下作用的抑制效應最為明顯，而且Raf及ERK相關蛋白隨著作用時間的延長，其表達水平明顯降低，這提示SAHA對CMS患者骨髓中紅系細胞具有顯著的抑制作用，而這一作用可能是通過調節Ras/Raf/MEK/Erk信號通路中相關蛋白下調實現的。除ERK通路介導的細胞增殖之外，組蛋白去乙?；侥壳耙舱J為與細胞的增殖存在密切相關，組蛋白的乙?；綄虻谋磉_起到了顯著的干預作用，當組蛋白處于乙?；癄顟B時，由DNA雙鏈與組蛋白構成的核小體其結構逐漸松散，大大提高了各種轉錄因子與目的基因的結合概率，從而導致相關蛋白表達水平的增加。而當組蛋白去乙?；?，核小體結構發生改變，使得DNA的轉錄水平受到抑制。這一發現已在多種腫瘤性疾病中得以驗證，通過采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑干預組蛋白去乙?；^程可有效地抑制腫瘤細胞的增殖[15-16]。SAHA是第二代組蛋白去乙酰化抑制劑，與第一代相比，其具有更高的抑制去乙?；Ч?。

綜上所述，Ras/Raf/MEK/Erk通路的異常激活可能參與了CMS的發病過程，SAHA可有效抑制CMS患者骨髓有核紅細胞的增殖，其機制可能與下調BRaf及ERK1/2蛋白表達水平有關。然而，由于受到樣本量等客觀因素的限制，數據偏倚在所難免，后續需進一步深入研究。