CO2激光處理對燈盞花種子萌發(fā)的影響研究

(西雙版納職業(yè)技術(shù)學院，云南 景洪 66100)

燈盞花學名短葶飛蓬(Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand. -Mazz.)，為菊科飛蓬屬(Erigeron)植物，以全草入藥稱燈盞細辛，為云南省優(yōu)勢道地藥材之一[1]。由于燈盞花中的黃酮類和酚酸類化學成分在治療心腦血管疾病方面有特效，所以被廣泛的用作益脈康片、燈盞花素片、燈盞細辛注射液等藥品的原料，藥材年需求量約為3 100 t，而且市場需求量在逐年遞增[2]。為滿足燈盞花原料的需求，國內(nèi)廣泛開展了相關(guān)的遺傳育種和規(guī)范種植的研究工作。盡管燈盞花優(yōu)質(zhì)品種的選育和栽培研究已經(jīng)取得了一定的進展，但目前以種子育苗移栽仍為燈盞花繁殖的主要技術(shù)手段之一[3-5]。然而燈盞花種子繁殖系數(shù)低，難以滿足市場需求[6]。 提高燈盞花種子的繁殖系數(shù)，對于燈盞花的人工種植具有積極地意義。

激光可以通過光、電、熱、壓力和磁效應(yīng)的綜合作用產(chǎn)生生物學效應(yīng)，從而影響植物的生理生化和遺傳效應(yīng)，廣泛應(yīng)用于遺傳育種和生物刺激效應(yīng)的研究[7]。已有學者嘗試使用激光處理燈盞花，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，He-Ne激光可以增加種子發(fā)芽率，保護愈傷組織的細胞膜，提高出愈率及愈傷組織誘導(dǎo)芽和生根效果；CO2激光可明顯影響種子化學成分[8-9]。但關(guān)于CO2激光對燈盞花種子發(fā)芽效果及移栽后幼苗生理特征的影響并未考察。本研究主要觀察了CO2激光對燈盞花種子萌發(fā)及幼苗生長特征的干預(yù)作用，以期為燈盞花的培育種植提供參考。

1 實驗材料

1.1 材料和試劑

燈盞花種子購于云南瀘西，手工去除其中不飽滿種子和絨毛。

1.2 實驗儀器

CWQ 600型CO2激光器，南京來創(chuàng)激光科技有限公司，波長1 060 mm；Vega數(shù)字激光功率計，北京時陽電子科技公司； DDB-303 A電導(dǎo)儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計，日本島津。

2 方 法

2.1 種子的激光輻照處理

選取大小均一的種子，100粒為1組，溫水浸泡2 h后進行輻照。所用的CO2激光擴束后光斑直徑為25 mm，照射距離30 cm，功率密度3 mW·mm-2。輻照時間分別為0，10，20，30，40，50 s (0 s作為對照組)。

2.2 發(fā)芽率和發(fā)芽勢的測定

激光輻照后，將種子置于放有2層濕潤濾紙的發(fā)芽皿中培養(yǎng)，置于恒溫箱內(nèi)，25 ℃下暗培養(yǎng)，定時換水并清理濾紙，觀察種子萌發(fā)情況。以胚根伸出等于或者超過種子長度視為發(fā)芽，第4天種子開始發(fā)芽，第7天統(tǒng)計發(fā)芽勢。每天記錄發(fā)芽種子數(shù)量至12 d[10]結(jié)束。實驗重復(fù)3次，計算平均發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

2.3 種子萌發(fā)過程中相關(guān)生理指標的測定

每3天測定子葉的細胞膜透性、可溶性糖、可溶性蛋白以及丙二醛(MDA)含量。采用電導(dǎo)儀測定法測定細胞膜透性[11]，蒽酮比色法測定可溶性糖含量[12]，考馬斯亮藍 G-250 法測定可溶性蛋白含量[12]。

表3 CO2激光輻照對燈盞花種子細胞膜透性的影響

輻照時間/s相對細胞膜透性/%0d3d6d9d12d011.86±1.1712.01±1.0712.16±1.3912.16±1.0212.09±1.051012.31±1.0411.68±1.6811.95±2.1812.19±1.1412.36±1.132012.51±1.8812.20±1.1212.06±1.5012.29±2.1311.79±1.123012.13±1.2512.29±1.9412.21±1.1111.99±1.0311.60±1.064039.22±4.39??45.55±4.32??50.70±5.78??54.60±5.48??59.91±7.29??5039.17±3.62??43.03±4.02??55.22±7.32??59.24±6.72??61.48±5.17??

表4 CO2激光輻照對燈盞花種子可溶性糖含量的影響

輻照時間/s可溶性糖含量/(mg·g-1)0d3d6d9d12d017.73±1.4915.80±1.7312.73±1.4811.32±1.959.64±1.711017.46±1.5116.35±1.8913.23±1.1711.14±2.258.90±1.572018.58±0.8412.14±1.05??11.55±1.629.17±2.386.44±1.31??3017.45±1.2513.17±1.18??11.31±1.709.53±1.905.99±1.03??4018.19±1.0314.85±1.8213.78±2.0512.80±1.5311.14±1.745017.43±1.5715.36±1.0114.09±1.1413.15±1.3611.18±1.27

2.4 燈盞花幼苗形態(tài)的觀察

每組種子中隨機選20株萌發(fā)12 d的幼苗移栽到Hoagland營養(yǎng)液[13]中進行水培。溫度10～25 ℃。每天補充蒸餾水保持培養(yǎng)液體積不變，并且觀察幼苗的生長情況。每5 d換1次營養(yǎng)液，30 d后測定株高、基葉長、基葉寬。營養(yǎng)液配方見表1。

表1 水培養(yǎng)用Hoagland營養(yǎng)液配方

成分含量/(mg·L-1)K2SO4607(NH4)2·HPO4115MgSO4493EDTA鐵鈉鹽20FeSO42.86Na2B4O5(OH)44.5MnSO42.13CuSO40.05ZnSO40.22(NH4)2SO40.02CaN2O6945

2.5 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 6軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，組間比較采用LSD檢驗方法。

3 結(jié) 果

3.1 CO2激光輻照對燈盞花種子萌發(fā)指標的影響

經(jīng)過CO2激光處理后，燈盞花種子萌發(fā)受到了明顯的影響。照射時間為20 s，30 s的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢明顯高于對照組；而照射時間超過40 s后，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢開始降低。

3.2 CO2激光輻照對燈盞花種子細胞膜透性的影響

CO2激光輻照10 s，20 s，30 s，對于細胞膜透性的影響不明顯；輻照 40 s，50 s細胞膜透性明顯升高，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞膜透性逐漸升高。

表2 不同波長激光對燈盞花種子發(fā)芽率的影響

時間/s發(fā)芽率/%發(fā)芽勢/%047.00±1.6324.33±1.251049.00±1.6323.00±0.272055.33±2.05?31.33±1.25??3064.33±2.05??35.67±1.25??4030.67±1.70??12.66±1.70??5021.67±1.70??9.33±1.25??

注：與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01。下同。

3.3 CO2激光輻照對燈盞花種子可溶性糖含量的影響

可溶性糖是種子萌發(fā)早期重要的能量物質(zhì)，對幼胚的初期生長具有重要的作用。CO2激光對子葉中可溶性糖總量影響不大，但是CO2激光輻照20～30 s后，3 d時糖消耗速度明顯加快，到12 d可溶性糖含量低于對照組。輻照40 s，50 s可溶性糖消耗速度明顯降低，說明CO2激光可以提高可溶性糖的利用效率，從而促進種胚的生長發(fā)育。

3.4 CO2激光輻照對燈盞花種子可溶性蛋白含量的影響

CO2激光輻照40 s，50 s子葉中可溶性蛋白含量明顯降低；輻照10 s，20 s，30 s以下蛋白含量無明顯變化。培養(yǎng)6～9 d，輻照20 s，30 s可溶性蛋白消耗速度加快，輻照40 s可溶性蛋白消耗速度減慢。

表5 CO2激光輻照對燈盞花種子可溶性蛋白含量的影響

輻照時間/s可溶性蛋白含量/(mg·g-1)0d3d6d9d12d013.41±1.0810.89±1.158.39±1.296.26±1.033.62±0.861013.43±1.0910.95±0.898.35±1.256.14±0.943.36±0.582013.09±1.0511.34±1.056.06±0.84??3.54±0.71??3.06±0.703012.89±0.9410.20±1.186.21±0.80??3.47±0.66??3.25±0.80409.64±1.24??9.97±1.829.95±1.318.09±0.837.58±1.62??508.98±1.16??9.90±1.019.99±1.287.97±0.547.53±1.67??

3.5 CO2激光輻照對燈盞花幼苗生長的影響

對萌發(fā)后的幼苗進行進一步的觀察研究，比較記錄激光處理后的燈盞花幼苗生長情況。觀察30 d幼苗生長情況，并且對株高、基葉長、基葉寬、單株基生葉數(shù)等指標進行了記錄和統(tǒng)計，結(jié)果見表6。

經(jīng)過CO2激光輻照10，20，30 s后，株高、基葉長度、寬度并無顯著性差異；輻照40，50 s的種子幼苗株高、基葉長均明顯低于對照組，表明過度輻照會使幼苗生長速度減慢。

表6 激光處理對于燈盞花幼苗形態(tài)的影響

輻照時間/s株高/cm基葉長/cm基葉寬/cm09.66±0.625.36±0.661.57±0.24109.42±0.805.65±0.651.54±0.18209.23±0.975.52±0.591.52±0.18309.58±0.785.68±0.631.60±0.12407.41±0.66?4.55±0.70?1.48±0.18506.64±0.81??4.45±0.74?1.42±0.14

4 討 論

使用激光輻照作物種子以達到打破種子休眠狀態(tài)，提高發(fā)芽率、發(fā)芽勢，促進幼苗生長及早熟高產(chǎn)，增強植物對環(huán)境的適應(yīng)能力等目的的研究主要集中于小麥、玉米、大豆等糧食作物[14]。激光刺激植物的機制主要是其可以通過電磁效應(yīng)、光效應(yīng)、熱效應(yīng)和壓力效應(yīng)等多種效應(yīng)誘發(fā)生物性狀及染色體的變異。

本研究中采用的CO2激光在較低功率下對植物產(chǎn)生的主要為光效應(yīng)和電磁效應(yīng)。實驗結(jié)果表明，CO2激光輻照20 s或30 s，燈盞花種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢明顯提高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過處理的種子子葉中可溶性糖及蛋白降低速度加快，可能是激光引起對上述物質(zhì)的利用效率提高促進了種子的萌發(fā)。CO2激光輻照40 s以上時，種子的萌發(fā)以及相關(guān)物質(zhì)的利用被抑制，并進一步影響了幼苗的生長。

試驗表明：適宜劑量的CO2激光輻照引起燈盞花種子內(nèi)酶原C-N鍵的斷裂，酶的活性被激活，加速了胚對可溶性糖、蛋白等營養(yǎng)成分的利用，增加了種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，起到了促進種子萌發(fā)的作用。CO2激光過度輻照則引起燈盞花種子內(nèi)蛋白變性，膜透性增加，酶的分子結(jié)構(gòu)破壞，抑制了種子的萌發(fā)[15]。本研究對比了CO2激光不同輻照時間對燈盞花種子萌發(fā)的影響，確定30 s為較優(yōu)的條件，為激光技術(shù)在燈盞花育種、種植方面的應(yīng)用提供參考。