轉基因杜仲再生體系的優化

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(1. 貴州大學生命科學學院/農業生物工程研究院，貴州省農業生物工程重點實驗室/山地植物資源保護與種質創新省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州省山地生態與農業生物工程2011協同創新中心，貴陽 550025；3.貴州大學生命科學學院，貴陽 550025； 4.貴州省農業科學院，貴陽 550006)

圖1 pGM 626-Act1-EuDIR3(A)和pSH 737-35S-EuDIR1(B)載體的T-DNA區域示意圖

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)，杜仲科杜仲屬，為第三紀孑遺物種，其干燥的葉和樹皮皆可入藥，是我國特有的傳統中藥材[1-2]。杜仲含有木脂素類、環烯醚萜類、苯丙素類等有效化學成分，具有雙向調節血壓、降血糖、滋養肝臟、抗菌、強化肌肉和骨骼、抗衰老和抗腫瘤等藥理作用[3-6]。此外，杜仲還是重要的膠源植物，可用于制作優良的海底電纜、飛機輪胎等材料[7-9]。

由于杜仲生長緩慢[10]，現代生物學開始利用植物組織培養技術來對天然代謝產物進行調控及生產[11-13]。杜仲愈傷組織誘導過程中，基本培養基有MS、B5、WPM和H等，其中MS培養基使用最多[14-18]。不同培養基對杜仲愈傷組織的誘導和繼代培養有不同的影響，MS培養基對杜仲幼莖愈傷組織的誘導效果較好，而B5培養基不僅能增加杜仲葉愈傷組織的誘導率，對莖和葉愈傷組織的繼代培養也有利[15]。在農桿菌介導植物的遺傳轉化過程中，提高遺傳轉化效率能為后續遺傳體系的建立、功能基因的表達調控等研究提供理論和技術支持[19]。對杜仲遺傳轉化的研究主要集中在培養基的添加成分和培養時間等影響因素方面。趙丹等[20]利用農桿菌介導法研究卡那霉素濃度、共培養時間等因素對杜仲遺傳轉化的影響。李巖等[21]首次證明ipt基因能夠增加杜仲不定芽的誘導率。周舒婷等[18]通過優化杜仲種子萌發過程中的種子切割方式、光照強度和轉化過程中的激素濃度，提高了杜仲下胚軸遺傳轉化效率。杜仲作為木本植物，在遺傳轉化過程中，不定芽的分化及生根較為困難，而有關培養基質對杜仲遺傳轉化影響的研究鮮見報道。杜仲下胚軸作為外植體能夠快速有效的進行杜仲愈傷組織分化和植株再生，但在經農桿菌遺傳轉化后，其在MS培養基中的分化和生根效率顯著下降[22]。因此，為提高杜仲遺傳轉化過程中不定芽的獲得率及生根率，本試驗主要就3種不同培養基質條件對遺傳轉化杜仲下胚軸的影響進行研究。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用杜仲種子由貴州大學農業生物工程研究院提供。

根癌農桿菌LBA 4404、大腸桿菌(E.coli)株系DH 5α及植物表達載體pSH 737-35S-EuDIR1和pGM 626-Act1-EuDIR3(圖1)均由本實驗室保存。

B5、MS和WPM培養基購自美國PhytoTechnology Laboratories公司；直接PCR擴增試劑盒購自上海生工生物工程；PCR所用引物由北京六合華大基因公司合成。

1.2 方 法

1.2.1農桿菌介導杜仲遺傳轉化

參照周舒婷等[18]的方法培養無菌苗并制備外植體，培養基配制參照趙丹等[20]、chen等[23]的方法，重懸液、共培培養基、篩選培養基、生根培養基各采用3種基質配比(MS：4.43 g·L-1；B5：3.21 g·L-1；WPM：2.41 g·L-1)，其中重懸液添加30 g·L-1蔗糖+3μmol·L-16-BA+3μmol·L-12-IP+20 mg·L-1As(pH=5.2)；共培培養基添加30 g·L-1蔗糖+3μmol·L-16-BA+3μmol·L-12-IP+20 mg·L-1As+2.4 g·L-1植物凝膠(pH=5.2)；篩選培養基添加30 g·L-1蔗糖+3μmol·L-16-BA+3μmol·L-12-IP+100 mg·L-1Tim+0.25 mg·L-1草銨膦(或25 mg·L-1卡那霉素)+2.4 g·L-1植物凝膠(pH=5.8)；生根培養基添加30 g·L-1蔗糖+1μmol·L-1NAA+100 mg·L-1Tim+0.25 mg·L-1草銨膦(或25 mg·L-1卡那霉素)+2.4 g·L-1植物凝膠(pH=5.8)。

表1 3種培養基中不定芽誘導情況

培養基轉化質粒平均外植體數/個愈傷組織生長情況平均出芽數/個平均出芽率/%B5A189多數長勢良好,生長旺盛,色澤鮮艷呈綠色,質地緊密脆嫩4020.99±0.25B240多數生長良好,呈黃綠色,質地緊密,少數枯死218.60±0.37MSA173多數呈黃綠色,部分或泛白或泛黃或泛褐1710.00±0.61B274生長較慢,色澤暗淡,部分泛褐,有的甚至枯死155.35±0.20WPMA161多數生長緩慢,部分色澤暗或泛黃或泛白或泛褐,生長不良且質地疏松,大部分不長愈傷,有的甚至枯死74.33±0.31B214呈黃綠色透明狀,少數枯死,或泛白或泛黃或泛褐83.76±0.75

注：A代表pGM 626-Act1-EuDIR3；B代表pSH 737-35S-EuDIR1。

注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)。圖2 3種培養基中轉化不同質粒的外植體出芽率情況

將外植體分別置于含質粒pGM 626-Act1-EuDIR3或pSH 737-35S-EuDIR1的3種農桿菌浸染液中浸染3 min，用無菌紙吸干浸染液，分別緊密排布于對應共培培養基上，28 ℃暗培3 d后分別轉入至各篩選培養基中。每2周更換1次培養基，10 d左右外植體周圍長出愈傷組織，隨后分化出不定芽，每2周更換1次培養基，統計外植體和不定芽數量，并計算出芽率。每種條件設置3個生物學重復。

出芽率(%)=(不定芽數/接種的外植體數)×100%。

1.2.2陽性芽的鑒定

GUS染色參照Jefferson[24]方法進行。將篩選出的杜仲不定芽葉片浸在GUS染液中，37 ℃反應8～10 h，取出葉片放入75%乙醇中脫色12 h，然后通過實體顯微鏡觀察外植體染色情況。同時對獲得的所有不定芽進行直接PCR檢測，擴增載體上的部分GUS基因，篩選出陽性芽。用于轉基因陽性芽檢測的PCR引物分別為F：5’-GGTGATTGATGAAACTGCTG-3’和R：5’-GAACATTACATTGACGCAGG-3’。PCR擴增體系20μL，擴增程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，60 ℃ 2 min，35個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，由凝膠成像系統拍照統計篩選出的轉基因陽性芽數量，并計算陽性芽數與不定芽數比值。

1.2.3陽性芽的生根培養

待上述陽性芽長度到達2 cm以上，將其從外植體上切下放入3種對應的生根培養基中，統計生根數并計算生根率。

注：WT：野生型；TP：轉基因型；M：DL 2000 Marker；-：陰性對照；+：陽性對照；1～3：轉基因陽性芽。圖3 部分轉基因陽性芽的GUS染色檢測(A)及直接PCR檢測(B)

生根率(%)=(生根的陽性芽數/陽性芽數)×100%。

1.2.4數據處理

試驗數據利用Microsoft office Excel 2003軟件及DPS 7.05軟件進行處理和分析，用LSD-t檢驗進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 杜仲不定芽再生

以杜仲下胚軸為外植體，B5、MS和WPM為培養基，選用2種不同載體(分別包含35S啟動子和卡那霉素篩選標記以及Act1啟動子和草銨膦篩選標記)進行杜仲遺傳轉化。轉入2種質粒的愈傷組織在B5培養基上長勢較好，色澤鮮綠或呈黃綠色，出芽數較多；而在WPM培養基上生長緩慢，色澤暗淡或呈黃綠色透明狀，甚至枯死，出芽數較少；在MS培養基上的外植體生長情況則介于上述2種培養基之間。此外，3種培養基中轉化質粒的出芽率差異顯著，在添加了細胞分裂素6-BA(3μmol·L-1)條件下，B5培養基中出芽率最高，為(14.79±6.20)%，而在MS和WPM培養基中出芽率分別為(7.68±2.37)%和(4.05±0.64)%。3種培養基中不定芽的誘導情況見表1和圖2。

2.2 轉基因陽性芽鑒定

通過GUS基因組織染色法和PCR檢測對不定芽進行鑒定(見圖3)，表明已經獲得轉基因陽性芽，在抗生素草銨膦(0.25 mg·L-1)或卡那霉素(25 mg·L-1)篩選壓力下，陽性芽數均占不定芽總數80%以上(見表2)，表明本研究所用的遺傳轉化體系較高效，此外，B5培養基上的比值在90%以上，說明B5培養基適合不定芽的誘導和再生培養。

表2 3種培養基中陽性芽獲得情況

培養基轉化質粒平均出芽數/個平均陽性芽數/個平均(陽性芽數/出芽數)/%B5A403794.16±0.81B211990.26±0.77MSA171586.67±1.17B151284.13±2.94WPMA7685.52±1.71B8787.04±2.62

注：A代表pGM 626-Act1-EuDIR3；B代表pSH 737-35S-EuDIR1。

2.3 3種培養基對陽性芽生根影響

本研究發現，3種培養基對杜仲遺傳轉化的生根率具有不同的影響。在添加相同生長素NAA(1μmol·L-1)和抗生素條件下，通過對陽性芽進行生根誘導培養，發現3種培養基中的生根率存在差異，B5培養基適于不定芽誘導，但卻不利于生根，WPM培養基上的生根率達到53.85%，遠高于另外2種培養基。3種培養基對杜仲陽性芽生根的誘導情況見表3。

表3 3種培養基中陽性芽生根情況

培養基總陽性芽數/個總生根數/個總生根率/%B516863.57MS8200WPM392153.85

3 討 論

杜仲是我國特有的名貴樹種，具有重要的經濟價值。作為木本植物，杜仲遺傳轉化體系的建立比較困難，導致杜仲功能基因的研究相對滯后。影響杜仲遺傳轉化的因素主要有篩選壓、激素濃度、菌液濃度、浸染時間和共培養時間等，提高轉基因幼苗的再生率可以獲得更高的轉化效率[20]。本實驗室前期研究發現，對種子切割方式、光照強度、共培養時間和轉化過程中的激素濃度等條件進行優化，可以提高杜仲遺傳轉化效率，現已初步建立了一套杜仲遺傳轉化體系[18,20]，然而在遺傳轉化過程中，愈傷組織再生的不定芽數量仍較少，且難以生根，嚴重降低了遺傳轉化效率。夏啟中等研究指出，不同培養基質在杜仲離體培養過程中對愈傷組織的分化和再生有不同的影響[14]，由此推測培養基質對杜仲遺傳轉化同樣具有較大影響。植物組織培養過程中的基本培養基有B5、MS、WPM、H和White等[15]，其中，B5培養基中的銨鹽濃度較低[25]，利于提高遺傳轉化過程中愈傷組織的誘導率和分化率；WPM為低鹽培養基，其培養基中的硝態氮和氨態氮比值相對較高[26]，利于陽性芽根原基的形成及發育；而MS培養基中的營養元素種類齊全且比例合適，屬于富集元素平衡培養基，對根和芽的誘導效果適中[16,27]，目前是杜仲組織培養過程中最常用的培養基。本研究發現，3種基質中，B5培養基的確可以促進杜仲不定芽再生，獲得較高的出芽率，而相較于另外2種培養基，WPM培養基則具有明顯的生根優勢。本研究通過篩選基本培養基來對杜仲遺傳轉化幼苗再生體系進行改良，確定了以B5培養基(含3μmol·L-16-BA和3μmol·L-12-IP)促進不定芽再生以及WPM培養基(含1μmol·L-1NAA)誘導生根的聯合使用條件對杜仲遺傳轉化的外植體進行培養，從而有效地提高了杜仲遺傳轉化幼苗數量，進一步為后續杜仲功能基因的研究提供轉基因材料。

本研究在對杜仲進行遺傳轉化時，采用2種含不同啟動子和篩選標記的表達載體，以期檢測培養基質的適用性。研究發現，2種載體雖然在不定芽的誘導上存在數量差異，但其在不同培養基質中有一致的生長趨勢，由此認為本研究所獲得的優化體系對不同載體均可適用。實驗中不定芽誘導數量上存在的差異可能是由于卡那霉素相較于草銨膦對不定芽的誘導有更明顯的抑制作用。因此，在構建杜仲遺傳轉化載體時，宜選擇含草銨膦篩選標記的載體。綜上所述，本研究對杜仲轉基因再生體系進行了優化，進一步保證了轉基因杜仲幼苗的獲得率及存活率，為后續杜仲功能基因的研究提供了技術支持。