北沙參花粉形態特征、活性及萌發條件研究

(河北中醫學院，石家莊 050200)

北沙參為安國八大祁藥之一，為傘形科植物珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)的根。北沙參味甘甜，是臨床常用的滋陰藥，養陰清肺，祛痰止咳，主治肺燥干咳、熱病傷津、口渴等癥[1]，為河北省的道地藥材，每年全國需求量在5 000 t左右，是一個大宗藥材品種。

注：A為ck(BK培養基)；B為TTC染色；C為I2-KI 染色；D為亞甲基藍染色。圖1 花粉的活性檢測

近年來，野生北沙參的資源已經無法滿足市場需要，市場上主要是人工栽培品種。對北沙參的研究主要集中在栽培條件[2]和藥理藥效研究[3-4]，對于北沙參的優良品種選育研究的較少。傘形科植物柴胡[5-6]、防風[7]、明黨參[8]、當歸[9]和阿魏[10]的花粉研究已經有報導，并通過對花粉的研究進一步對上述藥材進行良種選育，但北沙參的花粉研究還未見報道。因此，本文通過研究北沙參的花粉活性及貯存條件，觀察北沙參花粉的形態特征，為北沙參的良種選育奠定基礎。

1 實驗材料

樣品采自河北中醫學院藥用植物園，經河北中醫學院藥學院鄭玉光教授鑒定為珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)，選擇盛花期的枝條作為實驗材料。

2 實驗方法

2.1 花粉活性檢測

采用TTC法、I2-KI 染色法、亞甲基藍染色法和離體萌發法檢測花粉活性。TTC法和I2-KI 染色法參照《植物生理學實驗指導》第四版[11]的方法進行，亞甲基藍染色法參照宮麗婷等[12]方法進行。染色后，在10倍顯微鏡下觀察，每張裝片統計100個，重復3次。

離體萌發采用瓊脂培養，其中蔗糖分數、硼酸及氯化鈣的濃度均參照劉保才等[13]的方法進行，篩選出最適于北沙參花粉萌發的培養基配比。將花粉均勻抖落在凹面載玻片的培養基上，25 ℃恒溫培養12 h，利用10倍顯微鏡進行觀察，每張載玻片統計100個，重復3次。

2.2 貯藏溫度和時間的篩選

在北沙參的盛花期采摘其花序，輕輕的將花序放入牛皮紙袋內，分別置于常溫(室溫)、低溫(4 ℃)和冷凍(-20 ℃)條件下貯藏。每天10：00時取樣，將花粉抖落在瓊脂培養基上(培養基成分為2.1中篩選出的最適于北沙參離體萌發的成分配比)，于25 ℃恒溫黑暗培養12 h，然后進行花粉萌發的觀察和統計，連續觀察統計10 d。

2.3 貯藏濕度和時間的篩選

根據2.2的實驗方法篩選出最適于北沙參貯藏的溫度，將盛花期新鮮的北沙參花序的花粉抖落于相對濕度為15%、32%、52%、66%、81%、95%的密閉盒子的固體培養基上(培養基成分為2.1中篩選出的最適宜北沙參離體萌發的成分配比)，黑暗培養12 h后觀察統計花粉的萌發率，連續觀察15 d。

表1 不同鹽類在25 ℃密封中的相對濕度[14]

鹽相對濕度/%LiCl·H2O15CaCl2·2H2O32NaHSO4·H2O52NaNO266(NH4)2SO481Na2HPO4·12H2O95

2.4 花粉形態特征觀察

將盛花期的北沙參花序的花粉輕輕彈落在載物銅臺的導電雙面膠上，放入JEOL JFC-1600中噴射鍍金，然后置于JSM-6390 LV掃描電鏡下觀察。選擇不同的視野觀察北沙參花粉的群體、個體和花粉表面紋飾。測量20個具有代表性的花粉粒的極軸長和赤道軸長，計算極赤比，同時測量其萌發溝的溝寬和溝長，觀察萌發溝的形態。

2.5 數據統計與處理

利用Excel 2010軟件處理實驗數據，利用Photoshop 7.0軟件處理圖片。

注：A為BK培養基；B為第11組培養基。圖2 花粉的離體培養

表2 離體培養各培養基的組分和花粉萌發率

處理 各處理的組分 萌發率/% 蔗糖/%硼酸/(mg·mL-1)氯化鈣/(mg·mL-1)重復1重復2重復3平均值F值Pr>F多重比較1組00.000.0051.645.453.050.096.436<0.0001CD2組00.100.1027.028.021.125.4F3組50.100.1037.848.650.245.5CD4組100.000.1054.459.046.753.4C5組100.050.1041.444.745.643.9DE6組100.100.1054.441.339.645.1DE7組100.200.1052.757.562.557.6BC8組100.100.0042.143.735.940.57DE9組100.100.0541.138.249.342.9DE10組100.100.2038.739.632.937.1E11組200.100.1073.364.780.872.9A12組50.050.1039.030.032.133.7EF13組50.100.0569.854.065.062.9B14組100.050.0523.420.625.023FBK組10.10.03610.74.06.9G

注：不同字母表示差異顯著p<0.01。

3 實驗結果

3.1 花粉的活性檢測

分別用TTC法、I2-KI 染色法和亞甲基藍染色法對花粉粒進行染色觀察，結果表明，TTC不能將北沙參的花粉染成紅色(圖1 A)，用I2-KI對北沙參花粉粒進行染色，全部花粉粒都呈現黃色(圖1 B)，利用亞甲基藍對北沙參花粉粒進行染色，結果發現96%的花粉都被染成了藍色或淺藍色(圖1 C)，說明亞甲基藍染色法可以檢測北沙參花粉活性，而TTC法和I2-KI 染色法不適合檢測北沙參花粉粒活性。

3.2 花粉的離體培養

根據劉保財等[13]的花粉離體萌發

的最適條件的篩選方法，篩選出最適合北沙參花粉萌發的蔗糖、硼酸和氯化鈣的配比：20%蔗糖+0.1% mg·mL-1硼酸+0.1% mg·mL-1氯化鈣，萌發率可達72.9%(圖2 B，表2)。

3.3 貯藏時間和溫度對花粉活性的影響

在冷凍、低溫或室溫條件下，北沙參花粉的萌發率隨著貯藏時間的延長而下降。在室溫下保存的北沙參花粉的萌發率一直高于冷凍和低溫貯藏的花粉，冷凍貯藏的花粉萌發率最低且下降最快。這可能是因為北沙參的盛花期為北方的5月份，當時的氣候條件較適于花粉的存儲，同時由于采集并保存的是北沙參的花序，因此北沙參的花粉在常溫下一直保持較好的活性。而低溫和冷凍使北沙參花粉經歷了一個冷害的過程，從而使其萌發率降低。

圖3 不同貯藏方法和時間對北沙參花粉粒活性的影響

注：A為花粉粒極面觀；B為花粉粒赤面觀；C為花粉粒表面網孔；D為花粉粒萌發溝；E為花粉粒群體；F為將要萌發的花粉粒。圖5 北沙參花粉粒的形態特征觀察

3.4 貯藏時間和濕度對花粉活性的影響

由3.3的結果可知，隨著花粉貯藏時間的延長其生活力逐漸下降，只有在室溫大約25 ℃的情況下，北沙參的花粉才能夠在貯藏1 d后保持60%左右的萌發率。因此，選擇室溫下貯藏的北沙參花粉，將其置于不同濕度的環境中進行萌發，結果發現貯藏1 d的花粉由于不同的濕度呈現出不同的萌發率，在濕度15%～52%的情況下花粉的萌發率能夠達到70%以上，但是濕度達到60%以上后，花粉的萌發率只有50%左右。隨著貯藏時間的延長，各濕度情況下花粉的萌發率都在逐漸降低，而濕度超過60%以后，花粉的萌發率明顯降低。這說明北沙參的最適花粉萌發濕度在15%～52%之間，大于這一濕度的環境會導致花粉萌發的減少。

圖4 不同貯藏濕度對北沙參花粉粒活性的影響

3.5 北沙參花粉形態特征觀察

通過電鏡掃描觀察，北沙參的花粉赤道面觀為超長方形，極面觀為三角形。極軸長為38.5～44.5μm，赤軸長為12.1～15.0μm，極赤比為3.20；具有3個萌發溝，溝長為24.5～31.3μm，溝寬為3.09～7.04μm；花粉粒表面是縱橫交錯的網狀紋飾，其間具有一些大小不均的小孔(圖5 C)。在盛花期，花粉粒大部分發育良好(圖5 E)。收集盛花期后的花粉粒觀察會發現部分花粉粒有要萌發的跡象，或者說為萌發做好了準備(圖5 F)。

4 討 論

常用的花粉測定方法有TTC法、I2-KI 染色法、離體培養法等，亞甲基藍法并不常用于花粉活性測定。利用TTC法和I2-KI 染色法都不能很好的反映北沙參花粉的活性，這與防風花粉活力測定的結果相同[13]，而亞甲基藍染色可以使北沙參花粉呈現藍色、淺藍色等，可以很好的區分花粉是否有活性。但是，利用亞甲基藍染色會導致結果偏高，這在多種植物的花粉活性測定中都呈現這一現象[15-16]。

北沙參花粉的萌發未見明顯伸長的花粉管。觀察在25 ℃培養24 h，48 h甚至72 h的花粉粒，萌發的北沙參花粉粒只是在花粉的中部出現一個凸起，并未形成長的花粉管，這與傘形科防風的花粉管形態相似，而且防風的花粉粒形態也同北沙參相似為超長橢圓形。

大多數植物的花粉在低溫或超低溫保存的情況下其活性都較室溫或冷凍的花粉活性高[13,17]，但是貯藏在室溫的北沙參花粉的萌發率高于低溫及冷凍的花粉，這可能是因為北沙參的花粉盛花期在北方的5月份，此時的天氣干燥溫暖，濕度較低，很適合北沙參花粉的保存。而低溫以及冷凍的環境條件下，濕度相對較大，使北沙參的花粉經歷了一個凍害的過程，從而導致其生活力下降。 由于低溫環境下北沙參的花粉活性就開始下降，因此未利用超低溫來保存北沙參的花粉，北沙參的花粉是否適于超低溫保存需要進一步研究。

傘形科花粉形態共有6種，即近菱形、近圓形、橢圓形、近長方形、超長方形和赤道收縮形[18]。北沙參花粉形態為超長方形，極面觀為三角形，具有3個萌發溝，表面具有錯綜復雜的紋飾，與傘形科防風的花粉粒相似，但比防風的花粉粒更長，與傘形科棱子芹屬太白棱子芹的花粉外形相似[19]。在所有已知的傘形科各屬的花粉特征差別較大，即使同一屬花粉的外形、極面觀和表面紋飾也不盡相同，這可能與花粉的活性及萌發特性相關。因此北沙參不同類群之間花粉的差別以及其在良種選育中的作用將有待于進一步研究。