利用TCGA數據庫分析識別胃癌預后相關的特異性miRNA

吳逍風　李奉喜　黃道來　李貴彬　龐森　陳俊　黃精樂

【摘要】 目的 探討特異性miRNA與胃癌預后相關性。方法 從TCGA數據庫下載203例胃癌及24個癌旁組織miRNA和mRNA表達譜數據及相應的臨床資料。應用 “edgeR”R包分別對比分析癌與癌旁樣本miRNAs及mRNA差異性。結合生存資料， 采用KM曲線法進行差異miRNAs及靶基因生存分析。針對篩選出的靶基因進行KEGG信號通路富集分析及GO功能注釋。結果 miRNA生存分析結果表明， miR-17， miR-139， miR-323b， miR-365a， miR-551b， miR-7705， miR-877和miR-944與胃癌患者生存時間密切相關。KEGG通路和GO功能分析結果表明， 靶基因主要富集在“pathways in cancer”“MicroRNAs in cancer”， “MAPK signaling pathway”， “cell cycle”以及“apoptosis”等腫瘤相關通路。結論 篩選出關鍵miRNA及其靶mRNA與胃癌發生、預后密切相關， 可作為新的潛在的治療靶點和檢測預后的生物標志物。

【關鍵詞】 胃癌;miRNA;預后;生物標志物

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.09.019

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一， 2012年WHO資料統計全球每年胃癌新發病例超過95萬例， 每年因胃癌死亡的人數超過72萬人， 病死率占惡性腫瘤的第三位[1]。

2015年我國癌癥登記中心資料顯示， 胃癌發病率與死亡率逐年升高， 僅次于肺癌[2]。近年來， 隨著胃癌早期診斷及治療的迅速發展， 早期胃癌的5年死亡率顯著下降， 而晚期胃癌的的5年死亡率仍高達30%～50%[3]。因此， 尋找胃癌診斷、治療及預后相關的新的潛在生物標志物成為研究熱點。研究表明， miRNA可調控靶基因表達， 參與信號通路， 影響腫瘤發生發展， 發揮致癌或抑癌作用[4]。本研究從TCGA數據庫下載胃癌及其癌旁樣本RNA芯片數據， 探尋胃癌關鍵miRNA及其靶基因， 為胃癌診治、預后提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 從TCGA數據庫下載胃癌及癌旁樣本miRNA及mRNA芯片數據， 同一樣本中只有mRNA或miRNA芯片數據的樣本不納入研究， 最終共納入203例胃癌樣本及24例癌旁樣本芯片資料。203例樣本均經病理診斷確診為胃癌。

1. 2 胃癌miRNA及mRNA差異表達分析 收集樣本的RNA表達譜數據， 調用R語言edgeR包對比分析胃癌與癌旁組織RNA表達差異性， 篩選出差異倍數（fold change， FC）>2倍且P<0.05的差異表達RNA。

1. 3 生存分析 結合胃癌患者RNAs表達譜數據及生存資料， 采用 KM曲線法繪制生存曲線， 分析miRNA及其靶基因與胃癌患者預后相關性， P<0.05表示差異有統計學意義。

1. 4 胃癌miRNA靶基因篩選及其功能分析 基于篩選出的關鍵miRNA， 應用miRNA靶基因預測數據庫（miRDB、miRTarBase和TargetScan）篩選靶mRNA。為增加靶mRNA的可信度， 同時檢索3個miRNA靶基因預測數據庫， 靶mRNA需滿足以下條件：應同時包含于3個數據庫中;并且是胃癌差異表達mRNA。采用KOBAS 3.0進行靶基因KEGG信號通路富集及GO功能注釋分析。

2 結果

2. 1 胃癌患者臨床病理資料特征 胃癌患者平均年齡66歲， ≥66歲110例;<66歲93例。男性患者較女性多， 男女性別比約為1.57∶1。其中G3期患者占62.1%。

2. 2 胃癌特異性miRNA和mRNA差異分析 采用R包edgeR對比分析胃癌與癌旁樣本RNA表達差異， 滿足FC>2且 FDR<0.01的差異miRNAs 181個， 其中上調的147個， 下調的34個， mRNA 2516個， 其中上調的1335個， 下調的1181個。

2. 3 生存分析 應用KM曲線法繪制胃癌特異性miRNA生存曲線， 結果發現miR-17， miR-139， miR-323b， miR-365a， miR-551b， miR-7705， miR-877和miR-944等8個miRNA的差異表達與胃癌患者的生存時間密切相關。

2. 4 胃癌miRNA靶基因篩選及其功能分析 通過miRDB、miRTarBase和TargetScan， 檢索以上關鍵miRNA靶基因結果表明， 三個數據庫均能檢索到的靶基因494個， 其中有54靶基因為胃癌差異表達基因。采用KOBAS 3.0對54個靶基因進行KEGG通路及GO功能分析， 結果表明靶基因主要富集在“pathways in cancer”， “MicroRNAs in cancer”， “MAPK signaling pathway”， “cell cycle”以及“apoptosis”等腫瘤相關通路， 見表1;及“biological regulation”， “cell”， “cellular process”， “regulation of biological process”和“regulation of metabolic process”等功能關系密切， 見表2。另外， 生存分析結果表明， 靶基因ABCA1， DCC， FAM129A， KIF23， KPNA2， POLQ和TXNIP與胃癌患者的生存密切相關。

3 討論

目前， miRNA數據庫（miRbase）中收錄已識別的miRNA超過2500個， 與多種腫瘤增殖、侵襲、轉移及凋亡等相關。有研究表明， miRNA失調與胃癌發生、發展及預后密切相關。miR-130， miR-1266， miR-1207-5P及miR-1182促使胃癌細胞增殖與轉移[5， 6]。miR-15b， miR-16， miR-34， miR-181b， miR-181c和miR-497在胃癌中呈低表達， 促使基因BCL-2的表達， 抑制胃癌細胞凋亡[7]。miRNA與胃癌細胞增殖轉移等相關研究已取得一定的進展， 而與胃癌預后相關研究較少。

本研究通過生存分析發現， 8個miRNA的表達與胃癌患者生存時間顯著相關。其中miR-139， miR-323b， miR-365a及miR-551b高表達預示患者生存時間較短;miR-17， miR-877，?miR-944， miR-7705， 高表達者預后較好。研究表明， 以上miRNA與腫瘤發生發展均密切相關。Pan等[8]發現， miR-944可調控MACC1/Met/AKT信號通路阻止EMT的形成， 從而抑制胃癌細胞轉移。Zhang等[9]發現， miR-139可調控靶基因JUN表達， 參與胃癌發生發展。Wei等[10]發現miR-551b在卵巢癌干細胞中表達上調， 抑制抑癌基因Foxo3和TRIM31的表達。而有研究則發現miR-551b在胃癌中呈低表達， 抑制胃癌細胞增值和侵襲， 認為可能是通過誘導胃癌細胞自噬性凋亡[11]。郭水龍等[12]證實， miR-365可通過調控靶基因E2F2表達參與胃癌發生。另外相比正常組織， miR-17胃癌中呈高表達， 與胃癌大小、Lauren分型、pTNM分期相關[13]。此外研究表明， miR-323b高表達可誘導肺腺癌細胞轉移導致不良預后[14]。劉寒梢等[15]通過miRNA表達譜芯片研究發現miR-877可作為結直腸癌篩查和早期診斷的指標。研究發現， miR-7705與膀胱癌發生相關[16]。以上研究均未涉及miR-944， miR-139， miR-551b， miR-365， miR-17差異表達與胃癌預后相關性。同時miR-323b， miR-877， miR-7705與胃癌相關性亦未見報道。本研究結果表明miR-944，?miR-139， miR-551b， miR-365， miR-17與胃癌患者生存顯著相關， 可作為預后相關因子;miR-323b， miR-877及miR-7705與胃癌發生、預后緊密相關， 可能在胃癌早期診治及預后監測等方面發揮重要作用。

此外， KEGG信號通路及GO功能分析結果表明， miRNA靶基因主要富集在腫瘤相關通路及功能上。故認為miRNA可能通過調控其靶基因表達水平， 間接調控或參與以上腫瘤相關通路和功能， 在胃癌中發揮重要的作用。通過腫瘤基因數據庫（allOnco）發現， E2F1， CDKN1A等靶基因表達與胃癌確切相關。另外， ABCA1， TXNIP， KIF23等靶基因與胃癌患者總生存率顯著相關。

本研究利用TCGA數據庫中大樣本的胃癌芯片及臨床數據， 采用可靠的生物信息學方法， 識別多個與胃癌發生、發展及預后密切相關的miRNA及其靶mRNA， 為胃癌的診斷、治療及預后提供新的潛在的生物標志物。

參考文獻

[1] Ferlay J， Steliarova-Foucher E， Lortet-Tieulent J， et al. GLOBOCAN

2012 v1. 0， Cancer Incidence and Mortality Worldwide：IARC CancerBase No. 11 [Internet]. Lyon， France： International Agency for Research on Cancer， 2013.

[2] Chen W， Zheng R， Baade PD， et al. Cancer statistics in China， 2015. Ca Cancer J Clin， 2016， 66（2）：115-132.

[3] Hamashima C， Shabana M， Okada K， et al. Mortality reduction from gastric cancer by endoscopic and radiographic screening. Cancer Science， 2016， 106（12）：1744-1749.

[4] Kloosterman WP， Plasterk RH. The diversefunctions of microRNAs inanimal development and disease. Dev Cell， 2006， 11（4）：441-450.

[5] Duan J， Zhang H， Qu Y， et al. Onco-miR-130 promotes cell proliferation and migration by targeting TGFβR2 in gastric cancer. Oncotarget， 2016， 7（28）：44522-44533.

[6] Chen L， Lü MH， Zhang D， et al. miR-1207-5p and miR-1266 suppress gastric cancer growth and invasion by targeting telomerase reverse transcriptase. Cell Death & Disease， 2014， 5（1）：e1034.

[7] Toshihiro N， Hidekazu S. The Role of microRNA in Gastric Malignancy. International Journal of Molecular Sciences， 2013， 14（5）：9487-9496.

[8] Pan T， Chen W， Yuan X， et al. miR-944 inhibits metastasis of gastric cancer by preventing the epithelial-mesenchymal transition via MACC1/Met/AKT signaling. Febs Open Bio， 2017， 7（7）：905-914.

[9] Zhang Y， Shen WL， Shi ML， et al. Involvement of aberrant miR-139/Jun feedback loop in human gastric cancer. Biochim Biophys Acta， 2015， 1853（2）：481-488.

[10] Wei Z， Liu Y， Wang Y， et al. Downregulation of Foxo3 and TRIM31 by miR-551b in side population promotes cell proliferation， invasion， and drug resistance of ovarian cancer. Medical Oncology， 2016， 33（11）：126.

[11] 王婭南， 魏亞寧， 徐芳， 等. miR-551b在人胃癌組織中的表達及對胃癌細胞凋亡的影響. 華中科技大學學報（醫學版）， 2017， 46（4）：386-391.

[12] 郭水龍， 朱圣韜， 程芮， 等. miR-365通過靶向E2F2抑制胃癌細胞增生和腫瘤形成. 首都醫科大學學報， 2016， 37（1）：1-5.

[13] 姜雙， 王忠銳， 楊衛國， 等. miR-17在胃癌中的表達及臨床意義. 哈爾濱醫科大學學報， 2014（5）：399-401.

[14] Gonzalezvallinas M， Rodriguezparedes M， Albrecht M， et al. Epigenetically Regulated Chromosome 14q32 miRNA Cluster Induces Metastasis and Predicts Poor Prognosis in Lung Adenocarcinoma Patients. Molecular Cancer Research， 2018， 16（3）：390-402.

[15] 劉寒梢， 馬越云， 肖華勝. 血清微小RNA（miR-129-3p、miR-767-3p和miR-877*）在結直腸癌診斷中的價值. 腫瘤， 2012， 32（1）：42-48.

[16] Hu Y， Cheng C， Hong Z， et al. Independent prognostic miRNAs for bladder urothelial carcinoma. Oncology Letters， 2017， 14（3）：3001-3005.

[收稿日期：2018-12-11]