單味中草藥提取物對豬源沙門氏菌的抑菌效果

倪吉榮

(甘肅省武威市涼州區畜牧獸醫局，甘肅 武威 733000)

沙門氏菌寄生于人類和動物腸道內，屬于革蘭氏陰性桿菌，是一種常見的人獸共患病病原菌，它不僅能導致仔豬副傷寒、母豬流產等動物性癥狀，還能使人類發生傷寒、副傷寒、敗血癥、腸胃炎和食物中毒[1]。豬沙門氏菌病又稱豬副傷寒，致病菌主要有豬傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等，常發生于6月齡以下仔豬，以1～4月齡仔豬多發，臨床上常表現為急性(敗血癥)、亞急性和慢性三種類型，其中急性病死率達90%以上，慢性病死率達25%～50%，給養豬業造成了巨大的經濟損失[2]。據臨床試驗研究，引起豬沙門氏菌病的主要病原菌為豬傷寒沙門氏菌，傳統抗生素的廣泛應用雖然控制了沙門氏菌的傳播，但也存在著極為嚴重的安全隱患，導致了細菌耐藥性增強、畜產品抗生素殘留等問題，影響著豬沙門氏菌病的治療效果和畜產品質量安全，對人體健康也造成了極大的影響[3]。

中草藥作為我國傳統藥材，多系天然植物成分，具有抗菌、抗病毒、抗毒素、免疫調節等作用，且不易殘留、毒副作用小，具有西藥無法比擬的優勢[4]。但是，目前在中藥提取物對豬源沙門氏菌的抑菌效果的研究中，多見于復方中藥制劑對豬沙門氏菌病的治療效果評價，對于單味中藥提取物對豬源沙門氏菌病抑菌效果的評價研究較少，致使中藥提取物的臨床應用缺乏一定的依據。本文就單味中草藥對豬源沙門氏菌的抑菌效果進行分析，結果表明黃連等五種中草藥對豬源沙門氏菌有一定的抑制作用[5]，苦參抑制作用最強，且與抗生素效果一致，其次分別為黃芪、黃連、黃柏、甘草。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草購自毫州市林中森藥業銷售公司。硫酸慶大霉素購自杭州微生物試劑有限公司。豬霍亂沙門氏菌(NEAU0452)購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心[6]。營養瓊、酵母浸粉脂和瓊脂粉購自北京奧博星生物技術有限責任公司，牛肉浸膏和蛋白胨購自北京雙旋微生物培養基制品廠，營養肉湯培養基購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 提取物的制備

黃連單味藥提取物的制備：稱取一定質量的經粉碎處理的黃連，按料液比1∶10加入蒸餾水浸泡30 min，然后用超聲清洗儀處理20 min，再用電爐加熱至沸，保持微沸1 h，過濾后加入等量蒸餾水，保持微沸20 min，過濾，將兩次濾液合并，轉至60 ℃水浴鍋濃縮至0.5 g/mL。其余四種中藥提取制備同黃連。

1.2.2 各提取物抑菌效果的測定與評判

試驗分為空白對照組、陽性對照組、各單味中草藥組，空白組即為蒸餾水200 μL給藥，陽性對照組為硫酸慶大霉素10 μg/mL給藥，各單味中草藥組分別以0.5 mg/mL給藥[7]。

抑菌作用評定采用牛津杯法。將待試細菌制成細菌混懸液，調菌落總數為106CFU/mL，用滅菌棉簽在平皿培養基表面均勻涂布細菌混懸液[8]。采用無菌操作將經過高壓滅菌處理的牛津杯垂直放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基緊密接觸，隨后進行給藥，每種菌做5個平行[9]。加滿后置37 ℃培養16 h～18 h，觀察牛津杯孔周圍是否有透明圈，用游標卡尺直接測量其大小，記錄數據。判斷標準如下：抑菌圈直徑≥20 mm為高敏，抑菌圈直徑在15 mm～20 mm之間為中敏，抑菌圈直徑≤15 mm為低敏，無抑菌圈為耐藥[10]。

1.2.3 各提取物對致病菌最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)的測定

在試管架上依次排列裝有營養肉湯培養基的滅菌試管，在試管中加入一定體積的中草藥提取物使培養基與所加中草藥提取物溶液總體積為5 mL，制得藥物濃度分別為10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、80 mg/mL、160 mg/mL、320 mg/mL和640 mg/mL培養基。向上述所制含不同藥物濃度的營養肉湯培養基中分別加入 0.5 mL備用菌液，混勻備用。將各試管置于37 ℃恒溫培養20 h。從培養20 h的試管中取出100 μL混合液，均勻涂布于固體LB平板，37 ℃恒溫倒置培養24 h后觀察結果，以第一個出現稀疏單菌落的平板所對應的藥物濃度為最低抑菌濃度[11]。

1.3 數據分析

本研究數據采用SPSS 19.0軟件進行分析處理，試驗數據均為平均數和標準差。樣本獨立性采用t檢驗，數據有效性采用卡方檢驗。

2 試驗結果

2.1 各提取物對豬源沙門氏菌的抑制程度

五種中草藥提取物抑菌作用結果見表1。空白對照無抑菌圈，陽性對照抑菌圈直徑為(20.13±1.47)mm。與陽性對照組相比，苦參、黃芪組抑菌作用差異不顯著(P＞0.05)，敏感程度均為高敏；黃連、黃柏、甘草組的差異具有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，敏感程度為高敏或中低敏。

2.2 各提取物對豬源沙門氏菌的MIC

表2為各提取物對致病菌MIC的測定結果，五種MIC濃度分別為20 g/L、10 g/L、80 g/L、20 g/L、160 g/L。結果表明，抑菌效果最佳的是苦參，其次分別為黃芪、黃連、黃柏、甘草。

3 討論

隨著土霉素、四環素、磺胺類和喹諾酮類抗生素的廣泛使用，細菌耐藥性以及藥物殘留等問題極大地損害了食品質量安全，也威脅著人類健康。因此，尋找安全有效的飼用抗生素替代物是目前畜牧業研究的重要方向，中草藥作為傳統中醫藥的瑰寶，具有抗菌、抗病毒、抗毒素、免疫調節、補充營養、提高生產性能等作用，且不易殘留、毒副作用小，具有西藥無法比擬的優勢，在抗生素替代品研究和提高畜禽生產性能上倍受關注，成為了當今畜牧業和飼料業研究的熱點[12]。

本研究基于文獻的積累篩選了五種中草藥，包括黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草，通過制備提取物，分別分析其對豬源沙門氏菌的抑菌效果。黃連清熱燥濕、瀉火解毒，其主要成分小檗堿對金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肺炎鏈球菌、霍亂弧菌、炭疽桿菌、痢疾桿菌等均有較強的抗菌作用[13]。苦參苦寒降瀉、瀉火燥濕、清熱解毒，苦參堿可使雞大腸桿菌菌體變形、細胞質固縮、質壁分離、菌體中央出現空腔，最終引起細菌死亡[14]。黃柏苦寒沉降，清熱燥濕、瀉火解毒。黃芪可增強機體免疫功能，且具有較廣泛的抗菌作用[13]。甘草具有清熱解毒的功效，甘草黃酮類化合物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、酵母菌、真菌、鏈球菌等均有抑制作用[15]。

試驗結果表明，對照陽性硫酸慶大霉素組，苦參、黃芪組抑菌作用有顯著差異，敏感程度均為高敏；黃連、黃柏、甘草組敏感程度為中低敏，且差異顯著，具有統計學意義。此外，黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草五種中草藥提取物MIC濃度分別為20 g/L、10 g/L、80 g/L、20 g/L、160 g/L。綜上所述，黃連、苦參、黃柏、黃芪、甘草五種中草藥均對豬源沙門氏菌有一定的抑制作用，苦參抑制作用最強，與抗生素效果一致，其次分別為黃芪、黃連、黃柏、甘草。