實驗用小型豬封閉群中OB基因多態性的研究分析

陳志雄，胡志剛，王洪洋，張鶯鶯，曹建國，吳華莉，談永松，涂尾龍*

(1 原南京軍區司令部農副業基地，江蘇 南京 210016；2 原上海警備區南匯農副業基地，上海 200035；3 上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；4 上海種豬工程技術研究中心，上海 201106)

實驗用小型豬是我國寶貴的物種資源，也是現代生物醫學中應用最廣的實驗動物之一。由于小型豬體型小，操作方便，同時小型豬的血液生理生化指標和人的比較接近，皮膚等器官和人的比較相似，就目前來說小型豬應該是人類疾病動物模型的最佳實驗動物。作為實驗豬，小型豬的體型對實驗操作者來說尤為重要。在對小型豬進行育種的時候，所采用的方法與商品豬的不一樣，并不是挑選體型大的留種。因此，研究小型豬肥胖基因對于小型豬育種非常重要。

肥胖(Obese，OB)基因在調控實驗豬繁殖和采食等代謝方面發揮著極其重要的功能，其表達的產物是調控動物機體能量平衡和脂肪細胞分泌的重要作用。豬OB基因由3個外顯子和2個內含子組成，定位于18號染色體上，5’端是97 bp的先導序列，3’端是3.7 kb的非編碼序列。目前，OB基因一直是國內外學者的重要研究方向，有研究表明該基因的多態性和豬的多個性狀相關，如肉質性狀和繁殖性狀等。由于我國對實驗用小型豬的研究起步較晚，因此有關實驗用小型豬OB基因的研究鮮見報道。本研究采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)方法檢測實驗用小型豬OB基因的多態性，為實驗用小型豬育種提供分子標記輔助育種，積累實驗用小型豬的基礎資料，更好地對實驗用小型豬選種選育。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

本次試驗的常用試劑：2×Taq Master Mix(Dye Plus)購自南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號：P112；Pvu Ⅱ和Hinf Ⅰ購自New England Biolabs公司，貨號分別為：R0151S和R0155T；DL2000 DNA Maker購自上海翊圣生物科技有限公司，貨號：10501ES60；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號：DP304。

1.2 試驗動物

試驗動物選自上海市農業科學院實驗用小型豬封閉群核心群中30頭實驗用小型豬，年齡在2～3月。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬耳朵組織基因組提取

試驗時稱取0.3 mg豬耳朵組織，將其放入組織破碎機中破碎，將破碎的組織樣品放入1.5 mL的EP管中，使用天根公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取組織DNA，并將30個樣品分別標記。

1.3.2 OB基因3 469位點檢測(PCR-RFLP)

設計針對OB位點的引物，并委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

OB-F：5’-GAG CCA ACA TCT CTC TCG CTG AG -3’

OB-R：5’-GAC TCC TGG AAG CTC AGG TTT CTT C-3

1.3.3 PCR反應體系

按照表1配置PCR反應體系。

94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

1.3.4 酶切反應體系

酶切反應體系如表2所示。酶切溫度37 ℃，時間30 min。

2 結果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測

配置3%瓊脂糖凝膠，電壓120 V，時間12 min，結果如圖1、圖2和圖3所示。

2.2 統計基因型

從酶切結果條帶分析，實驗用小型豬OB基因的基因型如表3所示。

3 討論與分析

嚴燕等對圩豬OB基因單核苷酸多態性檢測發現，OB基因存在C/T、A/G、C/T和G/T這4個多態位點，群體存在A和B等位基因，表現3種基因型：AAABBB。Jiang等研究發現，4個多態位點分別位于867 bp、1 112 bp、3 469 bp和3 714 bp處。OB基因目前在動物體內有著非常廣泛的生理功能，不僅會影響動物的許多疾病，還與非常多的經濟性狀相關聯。Stephens對豬染色體研究發現，OB基因定位于18號染色體上，與已有研究的神經肽Y(NeuroPeptide Y，NPY)基因表達產物NPY一樣，都能增強促黃體素(Luteinizing Hormone，LH)的釋放，對豬的繁殖性能有很大的影響。但是，在小型豬方面，和肥胖相關的OB基因鮮見報道。本研究重點對實驗用小型豬的OB基因多態性進行了檢測，在30個個體中，5個個體為AA基因型，19個個體為AB基因型，6個個體為BB基因型。檢測主要是為了填補實驗用小型豬基礎資料，并為小型豬選育選種提供分子標記輔助育種。由于實驗用小型豬封閉群數量有限，需要等封閉群數量擴大，下一步對群體進行OB基因檢測，對基因型頻率進行檢測，更進一步的掌握實驗用小型豬的OB基因型，為小型豬選育更適合實驗動物提供有力支撐。