肝纖維化指標與miRNA-200b、TAP聯合檢測與原發性肝癌預后的相關性研究

李章勇，夏 川，李剛勇，顏 彥，林應標△

(湖南省郴州市第一人民醫院，1.檢驗醫學中心；2.肝病科，湖南郴州 423000)

原發性肝癌是目前我國最為常見的一種惡性腫瘤，具有較高的致死率，全球范圍內發病率均較高[1]。且原發性肝癌患者在發病早期缺乏典型的臨床癥狀，往往確診時已進入中晚期，臨床治療難度較大，預后多不良[2]。因此，對于原發性肝癌患者及早確診、及早治療在改善患者預后、提高生存率方面具有重要意義。MiR-200家族作為miRNA的重要組成部分之一，在多種腫瘤組織中均有異常表達，尤其是miR-200家族是抑制腫瘤轉移的關鍵步驟，在腫瘤轉移過程中發揮重要作用[3-4]。miR-200b為miR-200家族的重要成員，亦參與腫瘤細胞浸潤、轉移等多種生物學行為[5]。最近發現，正常細胞惡變時，細胞膜表面的聚糖結構發生變化，最常見的是N-鏈聚糖分支的增加，產生多種異常糖鏈糖蛋白即腫瘤異常蛋白(TAP)，可釋放到體液中。當腫瘤細胞產生的TAP量達到一定程度時，即可以在末梢血液中檢出[6]。亦有研究認為肝臟纖維化病情進展，最終可導致原發性肝癌。在此背景下，本研究旨在探討miRNA-200b、TAP蛋白表達水平與肝纖維化指標聯合檢測在原發性肝癌疾病診斷中的意義，為臨床做好原發性肝癌早期診斷提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2018年1月在本院接受治療的73例原發性肝癌患者病例資料作為研究對象，其中有男58例，女15例，年齡23～79歲，平均(57.11±8.32)歲。根據預后情況將患者分為預后良好組和預后不良組，以隨訪2年內復發或死亡為預后不良組，隨訪期間未發生病情惡化為預后良好組。結果預后良好患者45例，其中男37例，女8例，年齡23～76歲，平均(58.06±7.41)歲。預后不良患者38例，男31例，女7例，年齡24～79歲，平均(57.34±6.27)歲。兩組患者性別比例、年齡等基礎資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方案經醫院倫理委員會批準，入組患者及家屬均對本研究方案之前同意并簽署知情同意書。

1.2納入與排除標準 納入標準：(1)根據中國抗癌協會肝癌專業委員會修訂的肝癌診斷標準[7]；(2)樣本采集前未經過放療、化療或介入治療等措施。排除標準：(1)伴有自身免疫性疾病的患者；(2)伴有其他系統惡性腫瘤者。

1.3觀察指標及方法

1.3.1標本采集 入組研究者均使用真空采血管采集空腹靜脈血4 mL，室溫自然凝集30 min，室溫，4 000 r/min離心15 min，離心半徑16 cm，移取上層血清，-20 ℃保存備用。

1.3.2miRNA-200b mRNA檢測 術中采集肝組織標本，放入液氮中冷凍，之后轉存于-80 ℃冰箱保存。取肝癌及癌旁組織標本，研磨，采用TRIzol試劑盒提取組織中總RNA。所有操作嚴格按照說明書進行，并對獲得的總RNA進行檢測，取A260/A280>1.8的標本完成后續實驗。經反轉錄后得到cDNA，之后采用RT-qPCR測定肝癌組織中miRNA-200b mRNA的表達水平。

1.3.3TAP的檢測 取各組研究對象指端末梢血，推制成厚薄均勻的血片3張，自然干燥。將TAP檢測試劑充分搖勻，用滴管垂直滴加在血片上，每張3滴；等血片上凝聚助劑自然干燥形成圓形“斑點”，將標本置于TAP集成閱片儀下，尋找特異形態的凝聚物。TAP正常/無明顯凝聚物：面積0～121 μm2；TAP異常/凝聚物較小：面積121～225 μm2；TAP異常/凝聚物較大：面積≥225 μm2。試劑和儀器均購自浙江瑞生醫療科技有限公司。

1.3.4肝臟纖維化指標 測定儀器為新產業MAGLUMIN 2000全自動化學發光儀,試劑盒由深圳市新產業生物醫學工程有限公司提供,檢測入組研究人群血清透明質酸(HA)，Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、層粘連蛋白(LN)水平。

1.4統計學處理 采用EXCEL軟件進行原始數據的錄入和預處理，采用SPSS 22.2軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，采用Spearman相關性分析肝纖維化指標及血清TAP，癌組織miRNA-200b與預后的相關性，預后良好賦值為1，預后不良賦值為0，并采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與肝纖維化指標聯合檢測在原發性肝癌預后的評估價值，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組患者血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA比較 預后不良組患者肝組織miRNA-200b mRNA表達量均低于預后良好組，預后良好組患者血清TAP顯著高于預后不良組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者血清TAP、癌組織miRNA-200b水平比較

2.2兩組患者肝臟纖維指標比較 觀察組患者血清 PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平及肝纖維化指標與預后的相關性分析 如表3所示，血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平對原發性肝癌診斷的臨界值分別為0.58和94.02 μm2(r=-0.213、0.715，P<0.05)。肝纖維化指標PCⅢ、Ⅳ-C、LN和HA對原發性肝癌診斷的臨界值分別為102.3 μg/L、98.1 μg/L、122.4 μg/L和106.5 μg/L(r=-0.512、-0.608、-0.743、-0.673，P<0.05)。

表2 兩組患者肝臟纖維指標比較

2.4血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與肝纖維化指標聯合檢測在原發性肝癌預后的ROC曲線分析 血清血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與肝纖維化指標聯合檢測評估原發性肝癌預后的靈敏度、準確度和特異度分別為0.985、0.972和0.832。見表3、圖1。

表3 血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與

圖1 血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達

3 討 論

近年來，有研究表明腫瘤的生物學行為受到腫瘤自身及腫瘤微環境的影響，對其演變和轉歸均會產生重要影響[8-10]。趨化因子能夠將機體免疫細胞募集至腫瘤病灶處，分泌多種細胞因子，影響腫瘤的生長及附近血管的生成[11]。有大量報道表明，TAP與多種腫瘤的發生、侵襲轉移密切相關，且能夠對腫瘤患者的預后進行評估[12-15]。

本研究結果表明，預后不良組患者血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平高于對照組。相關研究表明miRNA-200b mRNA高表達者中位生存期長于低表達者，表明miRNA-200b mRNA高表達可提高患者生存率，延長生存期，與楊西勝等[16]報道基本一致。推測 miRNA-200b mRNA在肝癌發生中可能發揮抑癌基因作用，高表達miRNA-200b mRNA可能通過下調E-cadherin 或直接抑制EMT而減少腫瘤細胞遷移、侵襲的發生。

TAP是腫瘤細胞在新陳代謝過程中排放的糖蛋白和鈣-組蛋白復合物的總稱，TAP的出現間接表示細胞癌變的數量和程度。當TAP達到一定程度后，這類物質向血液排放，并較多地存在于外周血液。TAP在肝臟腫瘤具有較高表達，陽性率為70%～95%[17]。將其作為肝癌血清學檢測的指標，對發現癌前病變有較高的靈敏度和特異度。

正常肝臟細胞外基質的主要成分有蛋白多糖、LN和膠原。HA，一種蛋白多糖，在肝組織發生纖維化時，其在血清中的含量會明顯升高，同時分布于內皮細胞的HA受體會相應降低，其降解途徑受到抑制，因此在肝臟發生纖維化時，血清HA水平發生較大波動，是目前能夠反映肝臟纖維化較為敏感的生化指標之一[18]。慢性肝炎患者的血清PCⅢ持續升高提示病情向肝硬化發生了進一步的進展，而其血清含量的降低則預示了病情有所緩解。此外，LN及Ⅳ-C也是反映肝纖維化的重要指標。隨著肝炎患者病情進展，逐漸演變成肝硬化乃至肝癌，肝纖維化指標均會發生相應的變化，因此肝纖維化指標是反映機體肝臟健康狀況的重要指標。本研究結果表明，預后不良組患者血清PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA水平均低于預后良好組，說明肝癌患者的預后與肝纖維指標存在較好的相關性。

根據ROC曲線分析結果，結果表明血清血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與肝纖維化指標聯合檢測對原發性肝癌疾病預后評估的靈敏度、準確度和特異度分別為0.985、0.972和0.832。說明血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平聯合肝纖維化指標能夠對原發性肝癌進行有效診斷，其原因是血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平作為在肝癌發生過程中即會明顯變化的指標，用其預測肝臟疾病預后具有一定的臨床意義，而肝纖維化是肝臟病變逐漸進展接近肝癌的一個病理期，因此兩種指標聯合能夠兼顧特異度和準確性。

4 結 論

血清TAP、癌組織miRNA-200b mRNA表達水平與肝纖維化指標聯合檢測可用于對原發性肝癌的預后進行評估診斷，其靈敏度、特異度及準確度均較高，具有較好的臨床應用前景。