維生素D的檢測方法及其在藥品、食品、飼料、化妝品與臨床研究中的應用進展

林 紅，李忠紅

1福建省食品藥品質量檢驗研究院，福州 350001；2江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 210029

維生素D是固醇類衍生物，是一種重要的脂溶性營養素，以維生素D3（膽鈣化醇）和維生素D2（麥角鈣化醇）兩種形式存在。維生素D主要通過膳食攝入和紫外線照射下在體內合成[1]，其本身無活性，需在體內經過肝臟和腎臟羥基化后才能生成具有生物活性的1，25-二羥基維生素D。有關維生素D3的合成以及體內維生素D2與D3的代謝轉化示意圖見圖1[2]。雖然1，25-二羥基維生素D的生物活性最強，但25-羥維生素D是維生素D在人體代謝循環中的主要形式，因此常作為評價體內維生素D營養水平的指標。維生素D具有調節體內鈣、磷代謝水平，維持血漿鈣、磷水平穩定，促進牙齒和骨骼生長等重要作用，因此體內維生素D水平與一系列骨科疾病[3-5]相關。

隨著對維生素D作用研究的深入，有越來越多的研究表 明，維生素D涉及的功能還有影響細胞增殖分化、細胞凋亡、免疫調節[6]、基因組穩定、神經發生等，現有的對疾病的研究結果已經可以證明，維生素D缺乏與心臟病[7]、肺病、癌癥[8-9]、Ⅱ型糖尿病[10-12]、高血壓、精神類疾病[13]、多發性硬化、免疫疾病[14]、肥胖癥[15，16]、家族性地中海熱[17]、過敏性疾病[18，19]、生育相關疾病[20]、原發性痛經[21]等均存在一定關聯。因此，維生素D及其體內代謝物的檢測方法 （統稱為維生素D檢測方法）研究一直受到廣大科學工作者的重視，檢測方法在不斷發展，應用也日益廣泛。

維生素D的檢測方法目前主要有高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），以及各種免疫分析法，包括放射免疫法（RIA）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、化學發光免疫測定法（CLIA）、電化學發光免疫測定法（ECLIA）、全自動生化分析法等。根據檢測的目的以及檢測樣本中維生素D的含量水平，可以選擇不同的方法。

1 藥品、食品、飼料

含有維生素D的藥品、食品（包括保健食品）、飼料，作為維生素D強化補充劑，其中維生素D含量能達到一定水平，維生素AD軟膠囊中每粒含維生素D 300～1 000單位 （每單位相當于維生素 D 0.025μg，即為 7.5～25μg/粒），維生素 AD滴劑每 1 g 含維生素 D 500～5 000 單位（12.5～125μg·g-1），復合維生素注射液中維生素D含量為100μg·mL-1[22]；嬰兒配方乳粉中維生素 D 添加量一般在 7.8～9.0 μg/100 g[23，24]；作為保健食品的鈣片中維生素D含量在1.4～4.7μg·g-1[25]；飼料中維生素 D 的添加量在 1000～2000 IU·kg-1（相當于 2.5～5.0μg/100 g）[26]。對于這些樣品中維生素D的檢測首選HPLC法。《中國藥典》2015年版四部通則0722維生素D測定法就是收錄的HPLC法[27]。而不作為維生素D強化補充劑的普通食品中的維生素D的檢測，則需要使用LC-MS/MS法。

食品中維生素D的測定有國家標準GB5009.82-2016，食品中維生素A、D、E的測定[28]，其中收錄了兩種測定方法，并規定液相色譜-質譜聯用法適用于食品中維生素D2和維生素D3的測定，高效液相色譜法適用于配方食品中維生素D2或維生素D3的測定。

在飼料中，維生素D3的測定標準GB/T 17818-2010[29]中收載了兩種色譜方法：正相高效液相色譜法（硅膠Si60柱，以正己烷-1，4-二氧六環為流動相）和反相高效液相色譜法（RP-HPLC，C18柱，甲醇-水為流動相），樣品的前處理方法與《中國藥典》基本相同。

近年來，因為食品（包括配方食品）樣品前處理方法較繁瑣，不斷有人探索使用二維色譜與液相色譜-質譜聯用方法檢測食品中的維生素D，也都取得了較好的結果。

表1中匯總了近年來維生素D測定法在藥品、食品、飼料中的一些應用。

續表1

2 化妝品

我國《化妝品安全技術規范》（2015年版）[48]規定，維生素D2和維生素D3為化妝品的禁用物質，并對檢測方法做出了相關規定。齊曉飛等[49]采用高效液相色譜法對某化妝品進行了檢測，該方法對色譜柱的分離性能要求較高，其研究采用的STPAK C18-ES Tech Mate（北京泰克美科技公司）色譜柱分離效果較好。有研究[50]認為，維生素D具有抗惡性黑色素瘤的作用，但也有研究表明[51]，維生素D3化合物還能影響黑色素細胞成熟和分化，甚至促進黑色素瘤形成。因此，對化妝品中維生素D的檢測對保護消費者健康具有積極的意義。

3 臨床研究

目前公認的正常血清25-羥維生素D［通常以25-（OH）D 表示］濃度被定義為＞20 ng·mL-1（50 nmol·L-1），低于此濃度即為缺乏，＞200 ng·mL-1（500 nmol·L-1）被認為是毒性濃度[4，52]。 有嚴重缺乏者體內 25-（OH）D濃度會低于 5 ng·mL-1。臨床上檢測血清中25-（OH）D會選用檢測靈敏度更高的免疫法和液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）。

選擇免疫法是按照試劑盒生產企業提供的操作說明書來使用的；選擇液相色譜-串聯質譜法則需要對樣品前處理方法、液相色譜條件以及定量離子的選擇等一系列條件進行選擇與優化。Higashi T等[3]與 van den Ouweland JM等[53]對采用LC-MS/MS法測定維生素D及其代謝物的各種實驗條件進行了綜述，樣品前處理方法有液液萃取（萃取溶劑有乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷或混合溶劑）、離線SPE小柱凈化富集、在線柱切換凈化、衍生化后離線SPE小柱凈化富集、IDS（Iduronate-2-Sulfatase，艾杜糖-2-硫酸酯酶）抗體免疫提取（immuno extraction with IDS antibody）等，離子化方式有ESI與APCI兩種，定量方式一般采用內標法。

有不少學者對各種免疫法之間以及免疫法與LC-MS/MS法的檢測結果作過對比，趙蓓蓓等[54]對英國維生素D定量保障機構 （Vitamin D External Quality Assessment Scheme，DEQAS）組織的實驗室比對報告進行了匯總與分析，DEQAS報告中信息顯示來自53個國家、超過2 100家實驗室參加25-（OH）D的室間質評項目，參與的檢測方法種類超過26種。其中在上報參與評估的檢測方法中，數量最多的4種方法依次是：DiaSorin Liaison Total（CLIA 法）、IDS-iSYS（CLIA 法）、LC-MS/MS 法、Roche Total（CLIA 法）。使用 LCMS/MS法的參評實驗室超過150家，而且使用LC-MS/MS法參評的實驗室有逐年增加的趨勢。

張弘等[55]對化學發光法與酶聯免疫法檢測25-（OH）D的一致性進行了研究，結果兩種方法相關性良好，但兩組結果的預期偏差大于預設的允許誤差，檢測結果不一致。

武姍姍[56]對國內 3種檢測 25-（OH）D的方法（LC-MS/MS、ECLIA以及ELISA）進行了評估，比較它們同時測定同批血清25-（OH）D的差異性、一致性。結果當血清總25-（OH）D濃度在一定范圍內，且25-（OH）D2含量極低時，ECLIA、LC-MS/MS、ELISA測定血清25-（OH）D具有高度正向相關性，結合箱式圖、直線回歸方程、一致性檢驗分析，ECLIA所測血清25-（OH）D水平與LC-MS/MS、ELISA具有一定差異性，而LC-MS/MS、ELISA差異性小、一致性佳。

有文獻報道了[53]各種免疫法測定維生素D及維生素D體內代謝物的交叉反應性，結果顯示，免疫法確實只適用于測定血清中羥基維生素D總量。具體數據見表2。

表2 免疫法測定維生素D及維生素D體內代謝物的交叉反應性

目前臨床上主要以免疫法作為測定手段；尤其化學發光免疫分析法，無放射性污染，國內較廣泛使用該方法。表3匯總了近年來維生素D測定在臨床研究中的一些應用。

從表3數據中看出，不同實驗室測定的不同地區人群體內維生素D水平是不同的，這里有實驗誤差，也有人種差異。所以對于疾病診斷，各個醫院還是應該建立自己的正常人群體內維生素D水平的參考值，才能夠作出準確的判斷。Pudowski P等[73]介紹了中歐地區推薦的體內維生素D水平判斷標準，具體如下：①缺乏（deficiency）：＜20 ng·mL-1（50 nmol·L-1）；②略微不足（suboptimal）：20ng·mL-1（50nmol·L-1）～30ng·mL-1（75 nmol·L-1）；③充足（adequate）：＞30 ng·mL-1（75 nmol·L-1）～50 ng·mL-1（125nmol·L-1）； ④高補充 （high Vitamin D supply）：＞50 ng·mL-1（125 nmol·L-1）～100 ng·mL-1（250 nmol·L-1）； ⑤危險 （risky）：＞100ng·mL-1（250 nmol·L-1）； ⑥毒性（toxic）：＞200ng·mL-1（500nmol·L-1）

國內外臨床研究科學家建議[73]以下人群要進行血25-（OH）D水平篩查：①特殊人群，包括妊娠和哺乳期女性，有跌倒史和/或有非創傷性骨折史的老年人，缺乏日照的人群，肥胖兒童和成人，接受減重手術的人。②具有佝僂癥、骨軟化癥、骨質疏松癥、甲狀旁腺功能亢進癥、慢性腎臟病、肝功能衰竭、小腸吸收不良綜合征、急/慢性腹瀉、脂肪瀉、胰腺囊性纖維化、炎性反應性腸病、放射性腸炎、淋巴瘤、形成肉腫芽的患者。③使用了抗癲癇藥物、糖皮質激素、抗結核藥物、唑類抗真菌藥以及某些調脂藥物的人群。因此可以預見，今后維生素D檢測在臨床研究上的運用會更加廣泛。

表3 維生素D測定法在臨床研究中的應用

4 小 結

藥品、食品、飼料和化妝品中維生素D的法定檢驗方法多是采用HPLC法，這是針對體外測定；而對于體內檢測，由于正常血清中25-羥維生素D（25-（OH）D）的濃度水平較低，有些嚴重缺乏者體內25-（OH）D濃度甚至會低于5 ng·mL-1，故檢測血清中25-（OH）D及其代謝物的首選檢測方式就不再是HPLC法，而是選用靈敏度更高的免疫法和液相色譜-質譜法（HPLC-MS/MS）。通常可以根據檢測的目的、樣品的來源以及其中維生素D的含量水平，從而選擇不同的方法。

從體內檢測應用看，由于免疫法具有更高的檢測通量，更短的檢測周期，操作簡便等優點，是目前臨床上主要的測定手段，它適合于基層單位。但免疫法也存在只能測定血清中羥基維生素 D 的總量、不能區分 25（OH）D2和 25（OH）D3，且易發生交叉污染和靈敏度較差等缺點。還有，同樣是免疫法，它們之間在測定結果上也存在著一定的差異，特別是當血清中25（OH）D2含量極低時，用ECLIA法所測得血清中25（OH）D的水平就與用ELISA法存在一定差異；再如，同是免疫學方法的Roche法和Siemens法在檢測不同樣本基質之間的差異時，偏倚往往在-60%～30%不等，且沒有規律可循。因此，靈敏度、準確度和特異性都很高，尤其是采用同位素稀釋的LC-MS/MS法被公認為測定血清25（OH）D的金標準，室間比對報告顯示[54]，該法的結果偏倚在-10%～15%波動，而大部分的免疫學方法的結果偏倚在-30%～40%波動，反映出色譜或質譜法的變異性明顯優于免疫學方法。但LCMS/MS法會受限于儀器昂貴、較難普及、前處理操作繁瑣、對操作人員要求較高等情況，難以在廣大基層開展。色譜法或與質譜聯用法和免疫學方法哪一種更有優勢，不能絕對比較，采用哪種檢測方法應該根據各自的檢測目的和現有條件來選擇。

隨著維生素D檢測技術的不斷發展與創新，通過對這類產品的質量檢測和臨床治療藥物監測，必將對消費者和患者的健康安全發揮更加積極的作用。