羥乙基淀粉40氯化鈉注射液中細菌內毒素的檢查方法

王 瑤 ，劉 洋 ，胡 晨 ，孟長虹 ，史清水 *1南京醫科大學公共衛生學院，南京 11166；江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 1009

羥乙基淀粉為基藥新增品種，血容量補充藥，主要用于預防和治療各種原因造成的低血容量，包括失血性、燒傷性及手術中休克，血栓閉塞性疾患等[1]。羥乙基淀粉40注射液現行標準收載于衛生部藥品標準二部六冊（生化藥品第一分冊），但現在標準中采用的是熱原法。根據《中國藥典》2015年版四部通則規定，注射劑都應進行細菌內毒素或熱原檢查。熱原法存在使用家兔、實驗要求高、操作繁瑣、影響因素多等缺點。細菌內毒素法具有快速靈敏、重現性好、簡便易行等優點。為更好地加強藥品質量控制，對羥乙基淀粉40氯化鈉注射液采用細菌內毒素檢查法的可行性進行了研究。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

BET-48G細菌內毒素測定儀和ET-96型細菌內毒素凝膠法測定儀（天津市天大天發科技有限公司）；ZH-2 Blender渦旋混勻器（天津藥典標準儀器廠）；Eppenddorf移液槍（規格 250μL、1000μL，德國艾本德公司）。

1.2 藥品與試劑

羥乙基淀粉40氯化鈉注射液 （批號2A17030306、2A17030307、2A17030308， 山東齊都藥業有限公司）；細菌內毒素工作標準品 （規格80 EU/支，批號150601-201784，中國食品藥品檢定研究院）；鱟試劑（規格 0.1 mL，靈敏度 0.5 EU·mL-1，批號1705102，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑（規格 0.1 mL，靈敏度 0.5 EU·mL-1，批號 1707250，湛江博康海洋生物有限公司）；動態濁度法鱟試劑（規格1.25 mL/支，批號 1701222，檢測范圍 10～0.03 EU·mL-1，湛江安度斯生物有限公司）；細菌內毒素檢查用水（BET 水，規格 5 mL/支，批號 160006-201784，中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結果[2]

2.1 供試品細菌內毒素限值（L）

按《中國藥典》2015年版四部通則，細菌內毒素限值（L）一般按以下公式確定：

式中L表示供試品的細菌內毒素限值；K表示人每千克體重每小時最大可接受的內毒素的量，以EU·kg-1·h-1表示，其中注射劑K值為5EU·kg-1·h-1；M為人用每kg體重每小時的最大供試品劑量。

羥乙基淀粉40氯化鈉注射液每小時最大用量500mL，人體重按 60kg 計算，得 M=8.33mL·kg-1·h-1，L=0.6 EU·mL-1。考慮到臨床的聯合用藥，所以將本品的細菌內毒素限值定為0.5 EU·mL-1。

2.2 凝膠限度試驗[3]

2.2.1 鱟試劑靈敏度復核 將細菌內毒素工作標準品用1mL BET水溶解，在渦旋混勻器上混勻15min，然后稀釋成 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（鱟試劑靈敏度標示值λ為0.5 EU·mL-1）4個濃度，另加2管BET水作陽性對照（NC）。分別取兩個廠家鱟試劑按《中國藥典》2015年版四部通則“細菌內毒素檢查法”進行靈敏度復核試驗，結果見表1。

2.2.2 干擾預實驗 羥乙基淀粉40氯化鈉注射液最小有效稀釋濃度記為MVC，c=λ/L（L為本品細菌內毒素限值0.5 EU·mL-1，λ為鱟試劑標識靈敏度）。目前市售鱟試劑 λ 一般為 0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU·mL-1，則對應的供試品 MVC 為原液、2 倍、4倍、8倍和16倍稀釋液。將羥乙基淀粉40氯化鈉注射液分別用BET水稀釋成原液、2倍、4倍、8倍和16倍稀釋液，將此系列溶液記為NPC，同時在上述試驗液中加入細菌內毒素標準溶液，使每一濃度的試驗液中均含有2λ濃度的細菌內毒素，記此系列溶液為PPC。

取靈敏度為0.5 EU·mL-1的兩個不同廠家的鱟試劑，分別與上述NPC和PPC進行反應，每一濃度重復兩管，并設陰性對照（NC）和陽性對照（PC）。然后按《中國藥典》2015年版四部通則“細菌內毒素檢查法”操作，結果見表2。

表2 羥乙基淀粉40氯化鈉注射液干擾試驗預試驗

由表2結果表明，羥乙基淀粉40氯化鈉注射液對鱟試劑與細菌內毒素的反應無明顯干擾抑制作用。因此，正式干擾試驗的濃度選擇為原液。

2.2.3 正式干擾試驗 為了最終確認是否存在抑制因素的影響，進行以下正式干擾試驗。取羥乙基淀粉40氯化鈉注射液原液，取靈敏度為0.5EU·mL-1的鱟試劑，按《中國藥典》2015年版四部通則中的供試品干擾試驗項進行實驗，結果見表3。

表3 羥乙基淀粉40氯化鈉注射液的干擾試驗

由表3結果表明，NC都為陰性，Es（檢查用水的反應終點濃度的幾何平均值）和Et（供試品溶液的反應終點濃度的幾何平均值）在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）范圍之內，試驗有效。并且供試品在原液濃度下，對鱟試劑與細菌內毒素的反應均無明顯干擾抑制作用。

2.2.4 供試品細菌內毒素檢查 按 《中國藥典》2015年版四部通則“細菌內毒素檢查法”，用靈敏度為0.5 EU·mL-1的鱟試劑對供試品進行細菌內毒素檢查。取羥乙基淀粉40氯化鈉注射液原液（NPC），并同時設立供試品陽性對照管 （PPC）、NC管和PC管，結果見表4。

表4 羥乙基淀粉40氯化鈉注射液的細菌內毒素檢查結果

由表4結果表明，羥乙基淀粉40氯化鈉注射液經 2 個廠家的鱟試劑（λ=0.5 EU·mL-1）測試，結果均符合規定。

2.3 動態濁度法[4，5]

2.3.1 建立細菌內毒標準曲線 將3支定量鱟試劑每支中各加入1.25 mL BET水復溶，并在無熱原空安瓿中分別加入0.1 mL復溶的鱟試劑；將細菌內毒素工作標準品用BET水進行稀釋，制成含細菌內毒素濃度為 0.125、0.5、2.0 EU·mL-1的溶液， 再取這3個濃度的內毒素溶液0.2 mL分別加入到含有0.1 mL鱟試劑的反應試管中，充分混勻，插入BET-48G型細菌內毒素檢測儀內，同時做陰性管。當陰性對照的反應時間大于標準曲線最低點的反應時間時，結束反應。將全部數據進行線性回歸分析，得回歸方程為：lg t=2.860+（-0.272 lg c），r=-0.998（絕對值應不小于0.980），平行管之間的RSD均小于10%。式中 c為內毒素濃度（EU·mL-1），t為平均反應時間（s），結果見表 5。

表5 細菌內毒素標準曲線及可靠性分析（n=2）

2.3.2 確定供試品最大稀釋倍數 取本品原液，L為 0.50 EU·mL-1，標準曲線最低濃度（λc）為 0.031 25 EU·mL-1，供試品的最大有效稀釋倍數MVD=cL/λ=16。

2.3.3 供試品干擾試驗 將供試品用細菌內毒素檢查用水依次稀釋為 0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU·mL-1的溶液，記為s液；同時在上述試驗液中加入細菌內毒素標準溶液，使每一濃度的試驗液中均含有λm=0.5 EU·mL-1濃度的細菌內毒素，作為供試品添加在內毒素陽性對照管，記為t液。分別取上述各液0.1 mL，加入預先加有0.1 mL定量用鱟試劑的無熱原空安瓿中，混勻后立刻插入BET-48G型細菌內毒素檢測儀內進行自動檢測，其中每一濃度重復2支。按所得線性回歸方程計算出s液和t液的濃度 cs和 ct， 再按下式計算回收率 （R），R=（cs-ct）/λm×100%。

2.3.4 干擾驗證試驗 由表6可知，當供試品稀釋2倍及以上時，其回收率為112%～165%，符合《中國藥典》2015年版四部通則的要求，則在該試驗條件下不存在干擾。

另取兩批供試品 （批號為 2A17030307、2A17030308），按干擾試驗的方法分別制備2倍濃度的供試品溶液以及使每一濃度的試驗液中均含有λm=0.5 EU·mL-1濃度的細菌內毒素，作為供試品添加內毒素陽性對照管，依法檢查。結果B液回收率均在50%～200%，符合《中國藥典》2015年版四部通則的要求，且平均內毒素濃度乘以稀釋倍數后，小于規定的內毒素限值，供試品符合規定。

表6 干擾試驗及供試品細菌內毒素含量測定結果（n=2）

3 討 論

細菌內毒素檢查法有凝膠法（凝膠限度試驗和凝膠半定量試驗）和光度測定法（濁度法和顯色基質法）。該方法因為統一使用鱟試劑，所以成本低，準確率高。使用最多的是凝膠限度試驗，該試驗僅對內毒素含量是否超過限度值作出判斷，無法定量。定量檢測法是發展趨勢，更能直觀地評價藥品中細菌內毒素的含量，從而控制藥品質量，監控生產過程中的質量。

有文獻報道，目前國外對藥品的細菌內毒素檢查，采用定量方法測定的大于50%[6]。而最常用的定量檢測法是動態濁度法，其靈敏度高，操作簡單，可根據觀察曲線分析是否有干擾，儀器可以直接處理結果，減少二次處理數據錯誤的發生，更準確地測定內毒素的含量[7，8]。

本實驗中研究了用凝膠限度試驗和動態濁度法對羥乙基淀粉40氯化鈉注射液的細菌內毒素進行測定。凝膠限度試驗證明，本品對2個廠家的鱟試劑均無明顯干擾作用。動態濁度法通過計算加入內毒素的回收率來判斷是否存在干擾，《中國藥典》2015年版四部通則規定回收率在50%～200%。本試驗供試品稀釋2倍及以上，回收率達到要求，認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用，并對3批供試品進行檢查，結果均符合規定。

通過以上細菌內毒素檢查法之凝膠法試驗和動態濁度法試驗，可以證實羥乙基淀粉40氯化鈉注射液標準中的熱原檢查法，是可以用細菌內毒素檢查法予以替代，但仍需應用更多的樣品和試驗來證實。