痰喘半夏顆粒質量標準研究*

郭 斌 ，郭 青 ，葉曉蕓

1南京中醫藥大學 藥學院，南京 210023；2江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京 210019

痰喘半夏顆粒由制半夏、川貝母、沉香等24味藥組成，具有止咳、化痰、平喘的作用。用于治療新老咳嗽，痰多氣喘。現行質量標準收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第11冊[1]，本品制法為：將制半夏、川貝母、肉桂、豆蔻、沉香、丁香、西洋參、白芷、細辛、天竺黃10味粉碎成細粉，與朱砂粉配研，混勻。甘草、陳皮、川芎、麩炒枳殼、麩炒白術、麩炒青皮、澤瀉、麩炒白芍、山楂、制五味子、酸棗仁、干姜12味加水煎煮2次，第一次4小時，第二次3小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮成清膏，加入上述粉末，拌勻，制成顆粒，干燥，過篩，噴加薄荷油，即得。市售品為盒裝，3 g/袋×10袋/盒。標準中僅有性狀和水分的檢查，無鑒別和含量測定項目，水平低下，難以進行有效的質量控制。

痰喘半夏顆粒為國家中藥標準提高行動計劃的目錄品種，按照國家對中成藥標準提高的技術要求，對該品種現行標準進行了全面提高。采用高效液相色譜法建立了沉香的鑒別項；采用ICP-MS法對重金屬及有害元素鉛、鎘、砷、汞、銅進行了檢測并設置控制項；采用HPLC法對馬兜鈴酸A毒性成分和芍藥苷、沉香四醇、甘草酸、甘草苷、五味子醇甲5種指標成分進行了檢測，建立了毒性成分檢查項和指標成分含量測定項，在合理性、綜合性、可控性等方面以期達到該品的質量標準全面提高的目的。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相儀、Agilent 7700電感耦合等離子體質譜儀（美國安捷倫公司）；德國 Sartorius CPA224S萬分之一電子天平；瑞士Mettler Toledo MX5百萬分之一電子天平。

1.2 藥品與試劑

對照品：芍藥苷（純度≥96.5%，批號110736-201035）、沉香四醇 （純度≥98.3%，批號111980-201602）、甘草苷 （純度≥93.1%，批號111610-201607）、甘草酸 （純度≥93.0%，批號110731-201619）、五味子醇甲（純度≥98.1%，批號：110855-201311）、沉香對照藥材（批號 120788-201309）均購自中國食品藥品檢定研究院。

標準溶液：鉛（標準物質號GBW08619）、鎘（標準物質號GBW08612）、 砷 （標準物質號GBW08611）、汞（標準物質號 GBW08617）、銅（標準物質號GBW08615），均購自中國計量科學研究院。

10批痰喘半夏顆粒 （按編號S1至S10的批號依 次 是 20160401、20160601、20160602、20170101、20170102、20170103、20170801、20171201、20171202、20180302）和陰性樣品均由貴州遠程藥業有限公司提供，規格均為3 g/袋。

HPLC法所用試劑為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 液相鑒別

取“2.3.3”項下溶液作為供試品溶液。另取缺沉香的陰性樣品2 g，同法制備，作為陰性溶液。又取沉香對照藥材0.5 g，加70%甲醇溶液10mL，超聲處理30 min，濾過，取續濾液作為對照藥材溶液。再取沉香四醇對照品，加甲醇制成每毫升含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。照高效液相色譜法（《中國藥典》通則0512）試驗，按“2.3.1”項下色譜條件操作。精密吸取供試品、陰性、對照藥材、對照品溶液各20μL，依法測定。結果見圖1，在供試品色譜圖中，呈現與沉香四醇對照品保留時間相一致的色譜峰，并同時呈現與對照藥材中另一特征峰（其相對于沉香四醇的保留時間為2.95）保留時間相一致的色譜峰，陰性無干擾。

圖1 沉香液相鑒別圖

2.2 檢查

2.2.1 重金屬及有害元素的檢測

（1）質譜條件：冷卻氣流量：15 L·min-1；輔助氣流量：0.8L·min-1；載氣：0.8L·min-1；補償氣流量：0.8L·min-1；霧化器：Babington；掃描次數：3 次；采集模式：Spectrum；檢測方式：自動。

（2）標準曲線溶液制備：精密吸稱取Pb、Cd、As、Cu 4種元素的標準溶液適量，加10%硝酸制成含 Pb 1、5、10、20 ng·mL-1， 含 Cd 0.5、2.5、5、10 ng·mL-1，含 As 1、5、10、20 ng·mL-1，含 Cu 50、100、200、500 ng·mL-1的混合標準曲線溶液。精密吸稱取Hg的標準溶液適量，加10%硝酸制成含Hg 0.2、0.5、1、2、5ng·mL-1的單元素標準曲線溶液。

（3）供試品溶液制備：取研細后的本品約0.1 g，精密稱定，置于聚四氟乙烯微波消解罐中，加硝酸5 mL，密塞，按表1方法消解，消解后放冷，將消解液用去離子水分次洗滌、轉移到50 mL量瓶中，并定容至刻度，搖勻，精密吸取1 mL于25mL量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液①。另精密吸取供試品溶液① 1mL，置250mL量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液②。

表1 微波消解程序

（4）方法學考察：將標準曲線溶液按濃度由小到大依次進樣，得各元素的檢測限、線性范圍、回歸方程、相關系數，見表2。結果顯示，各元素在選定的濃度范圍內線性關系良好。

表2 方法檢測限、線性范圍和相關系數結果

（5）朱砂專屬性試驗：取不含朱砂的陰性樣品，同法制備，測得各元素的含量分別為Pb 1.08μg·g-1、Cd 0.03μg·g-1、As未檢出、Hg 0.73μg·g-1、Cu 5.61μg·g-1。朱砂主要含 HgS，Hg在本品中平均含量為8398.39μg·g-1，而其陰性樣品中 Hg 含量僅為 0.73μg·g-1，說明本品中Hg基本來自朱砂；其他4種元素在朱砂陰性和陽性樣品中含量基本沒有區別，說明處方中其他藥味對重金屬及有害元素有微量表現。

（6）樣品測定結果：取10批本品，依法制備，供試品溶液①用于測定 Pb、Cd、As、Cu；供試品溶液②用于測定Hg。根據標準曲線計算含量。見表3。

表3 5種重金屬等有害元素測定結果

2.2.2 馬兜鈴酸A檢查

（1）色譜條件：色譜柱為YMC Hydrosphere-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.5%磷酸溶液（38∶62）；檢測波長：320 nm；進樣量：20μL。

（2）對照品溶液制備：取馬兜鈴酸A對照品適量，加70%甲醇制成每毫升含0.1 mg的溶液，即得。

（3）供試品溶液制備：取研細后的本品20 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加甲醇150 mL，超聲處理（720 W，40 kHz）30 min，取出，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過。精密吸取續濾液100 mL，蒸干，固體物加0.5%氫氧化鈉溶液30 mL溶解，分次轉移到分液漏斗中，用三氯甲烷萃取3次，每次25 mL，棄去三氯甲烷液。水層用鹽酸調pH至2，用三氯甲烷萃取4次，每次25 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，固體物用甲醇溶解并轉移到10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，離心，取上清液，作為供試品溶液。

（4）陰性溶液制備：取缺細辛陰性樣品20 g，按供試品方法制備，作為陰性溶液。

（5）專屬性試驗：取對照品、供試品、陰性溶液分別測定。陰性樣品無干擾。見圖2。

（6）檢測限試驗：精密吸取馬兜鈴酸A對照品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取此溶液1 mL，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10μL，注入液相色譜儀測定，計算信噪比S/N=3.4，馬兜鈴酸A的檢測限為0.5155ng。

（7）樣品檢測：取S1~S10共10批痰喘半夏顆粒，依法測定。在10批供試品中均未檢出馬兜鈴酸A。

圖2 馬兜鈴酸A專屬性HPLC色譜圖

2.3 5種指標成分的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：YMC-Hydrosphere C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 min，15%A；24 min，18%A；28 min，38%A；59 min，47%A）； 檢測波長：218 nm（五味子醇甲）、235 nm（芍藥苷）、250 nm（沉香四醇、甘草酸）、272nm（甘草苷）；進樣量 20μL。

2.3.2 對照品溶液制備 取芍藥苷、沉香四醇、甘草苷、甘草酸和五味子醇甲對照品適量，加甲醇制成每毫升含上述成分依次為195.51、42.80、91.31、77.60、3.96μg的混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 取研細后的本品2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%甲醇20 mL，超聲處理（720 W，40 kHz）30 min，取出放冷，用 70%甲醇補足減失重量，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。

2.3.4 陰性溶液制備 取缺白芍、缺甘草、缺沉香、缺五味子的陰性樣品各2g，按供試品方法分別制成陰性溶液。

2.3.5 進樣精密度試驗 取同一混合對照品溶液按“2.3.1”色譜條件連續進樣6次。芍藥苷、沉香四醇、甘草苷、甘草酸和五味子醇甲的峰面積的RSD依次為 0.97%、1.32%、0.82%、1.85%和 1.71%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 線性關系考察 取同一混合對照品溶液，分別進樣 1、3、9、15、25、35 μL。以進樣量（ng）為橫坐標，以峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線。5種成分在一定的進樣量范圍內線性關系良好。見表4。

表4 5種指標成分的線性回歸方程及線性范圍

圖3 5種指標成分專屬性HPLC色譜圖

2.3.7 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液分別測定，見圖3。在供試品中5種指標成分分離良好，陰性樣品對5種成分均無干擾。

2.3.8 重復性試驗 取編號為S7的供試品6份，按照“2.3.3”項下方法制備，依法測定，在6份供試品中芍藥苷、沉香四醇、甘草苷、甘草酸和五味子醇甲的峰面積的RSD依次為0.70%、0.68%、1.09%、0.96%和0.73%（n=6），重復性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取編號為S7的供試品6份，每份約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液10 mL，按“2.3.3”項下方法制備，依法測定，計算加樣回收率。結果上述5種成分的平均加樣回收率分別為93.33%、107.39%、100.69%、102.19%和 90.83%，RSD分別為 1.83%、1.09%、1.75%、1.60%和 1.98%（n=6）。

2.3.10 穩定性試驗 精密吸取同一份編號為S7的供試品溶液，分別于 0、4、8、12、16、20、24h 進樣。結果上述5種成分的RSD分別為0.47%、071%、1.10%、1.0%、0.82%（n=6），供試品溶液在24h內穩定。

2.3.11 樣品測定結果 取10批痰喘半夏顆粒，依法測定，按外標一點法計算各成分的含量，見表5。

表5 樣品測定結果

3 討論

3.1 重金屬及有害元素限度的制定

結合10批樣品的測定結果，參照《中國藥典》中甘草項下的相關規定[2]：Pb≤5.0mg·kg-1、Cd≤0.3mg·kg-1、As≤2.0 mg·kg-1、Cu≤20.0 mg·kg-1、Hg≤0.2 mg·kg-1。所有批次中的 Pb、Cd、As、Cu 的含量均遠低于該標準要求，可不做限度規定。處方中朱砂以水飛后極細粉入藥，投料量為24 g，制成總量1 800 g，其中含有的Hg既是有效成分，又是毒性成分。由缺朱砂陰性樣品可知，本品中的Hg基本來自朱砂?！吨袊幍洹芬幎ㄋw朱砂HgS含量不得少于98.0%[3]，相當于Hg不少于84.5%，因此本品中Hg含量應不得少于 11 266.67μg·g-1。如按樣品中 Hg實測均值8 398.39μg·g-1計算，則朱砂轉移率為74.5%；如按實測最低值6 142.80μg·g-1計算，則朱砂轉移率為54.5%，轉移率顯然偏低，有可能水飛時損失嚴重。朱砂有毒，不宜大量服用[4]，在《中國藥典》中的最大日服量為0.5 g，相當于Hg的最大日服量不得過0.43 g，本品最大日服量為9 g，如果本品中的朱砂嚴格按照處方量投料，則Hg的最大日服量為0.1014g，遠低于《中國藥典》規定的0.43 g/天。表明本品在規定的劑量下用藥是安全的。為保障朱砂療效的同時也保障其安全性，應規定Hg含量的上下限：本品中Hg的下限按照實測平均值的80%規定為20.2 mg/袋；上限按照本品中Hg的最大日服量制定為33.8mg/袋；本品Hg限度范圍制定為（20.2~33.8）mg/袋。

3.2 馬兜鈴酸A限度的制定

處方中細辛以生粉投料，其中含有馬兜鈴酸類肝腎毒性化合物[5，6]，細辛的投料量為 192 g，制成總量1 800 g，如果用符合《中國藥典》規定（馬兜鈴酸A含量≤0.001%）的細辛投料[7]，則本品中馬兜鈴酸A含量最高為3.2μg/袋。

3.3 5種指標成分含量限度的制定

五味子醇甲的平均含量為 0.037 mg·g-1，即0.003 7%，相當于37個ppm，由于含量過低，故不規定含量限度，以薄層鑒別即可。其余4種成分按照含量測定結果平均值的80%來規定限度：本品每袋含芍藥苷、沉香四醇、甘草苷和甘草酸依次不得少于 4.3、1.0、1.8、2.0 mg。此外，本品在控制馬兜鈴酸A限度的同時，在后續質量研究工作中還應進行細辛脂素的含量測定研究，以保證藥效。