潞黨參口服液對免疫抑制小鼠的免疫調節作用

胡天惠，林 超，項媛媛，辜衛紅

1淮安市婦幼保健院，淮安 223002；2南京中醫藥大學 藥學院，南京 210023

黨參為補脾益氣類中藥，潞黨參屬黨參中的上品，為山西潞州道地藥材[1]，含有大量多糖、蛋白質、苷類、維生素和礦物類成分，是中醫臨床上常用的中藥之一，具有補中益氣、健脾益肺、養血生津的作用，主要用于治療四肢無力、食欲不佳、氣津兩虛、氣血雙虧以及血虛萎黃等諸癥[2-4]。臨床研究發現，潞黨參能夠增加癌癥放療患者白細胞數量、體液IgM水平、增強免疫功能[5，6]，表明潞黨參有增強免疫抑制機體的免疫功能。由潞黨參制成的潞黨參口服液具有補中益氣、健脾益肺、滋補強壯等功效，臨床上已廣泛用于脾虛型小兒泄瀉，婦產科貧血，慢性胃炎，慢性腎炎及放化療后脾肺氣虛等癥候，但是其能否增強免疫抑制小鼠的免疫功能未見報道。本研究采用環磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型[7，8]，探討潞黨參口服液對免疫抑制動物的免疫調節作用，為其臨床使用和后續研究提供依據。

1 實驗材料

1.1 藥品和試劑

潞黨參口服液（規格10 mL/瓶，批號：1801303，山西正來制藥有限公司，潞黨參提取物，每毫升相當于生藥量1.667 g，使用時采用生理鹽水稀釋至實驗所需濃度）；10%綿羊紅細胞 （批號20180618，南京博碩生物科技有限公司）；RMPI1640培養基 （批號1918892，美國 Gibco公司）；脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS，批號 L2880，北京索萊寶科技有限公司）；刀豆蛋白 A （Concanavalin A，ConA，批號C2967，美國sigma公司）；胎牛血清（批號 11H228，依科賽生物科技有限公司）；噻唑藍 （MTT，批號SP1175，美國sigma公司）；小鼠 IL-2 Elisa試劑盒（批號L0603429）、小鼠IL-4 Elisa試劑盒 （批號L0815439）、小鼠 IFN-γ Elisa試劑盒 （批號L1126357），均為武漢華美生物工程有限公司；其余試劑均為化學純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器

BioTek酶標儀 （美國博騰儀器有限公司）；TC3111恒溫細胞培養箱 （美國 Thermo公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；Primo Star倒置顯微鏡（德國ZEISS公司）。

1.3 實驗動物

ICR 小鼠 240 只，體重（20~22）g，雌雄各半，由揚州大學比較醫學中心提供，生產許可證號SCXK（蘇）2017-0007。動物飼養于無特定病原體動物（Specific Pathogen Free，SPF）屏障環境，溫度 20 ℃～22℃，相對濕度60%～70%。

2 實驗方法

2.1 模型建立、分組及給藥

將240只ICR小鼠按照體重隨機分6組，分別為：空白組、模型組、香菇多糖陽性藥（0.2 g·kg-1）組和潞黨參口服液低、中、高組（3.3、6.6、13.2 g·kg-1），每組40只。除空白組外，其余各組均腹腔注射環磷酰胺50 mg·kg-1，每天一次，連續3 d建立免疫缺陷小鼠模型[7，8]。動物造模后 1 d開始給藥，連續14 d，空白組和模型組均灌胃給予生理鹽水。

2.2 動物體質量和臟器指數的檢測

每組取10只小鼠，均于第14天給藥后，禁食不禁水12h，稱取小鼠的體質量，摘眼球取血分離血清（用于后續血清細胞因子檢測），乙醚麻醉后處死小鼠，解剖小鼠分離胸腺和脾臟，小心取出周圍多余的結締組織，吸水紙吸去表面殘血，稱重并記錄。

2.3 小鼠血清中溶血素測定

每組取10只小鼠于造模后第一天腹腔注射2%綿羊紅細胞0.2 mL進行免疫，當天開始給藥，末次給藥24h后小鼠摘眼球取血，室溫靜置3h，1500r·min-1離心15 min，分離上層血清。用生理鹽水將血清稀釋100倍。取1 mL稀釋好的血清樣品至試管中，依次加入5%綿羊紅細胞0.5 mL和10%豚鼠血清0.5 mL，37℃培養箱孵育30 min后冰水浴終止反應，取上清液1 mL于10 mL試管中，加入都氏液4 mL；同時另取一試管，加入5%綿羊紅細胞懸液0.25mL后加入都氏液4mL，作為綿羊紅細胞的半數溶血值[9]。以不加小鼠血清的空白管調零，于540 nm處進行比色檢測，測定各管的OD值并計算半數溶血值（HC50）。公式為：

2.4 脾臟淋巴細胞增殖反應

每組取10只小鼠于末次給藥后24 h，麻醉處死，置于75%乙醇中浸泡3 min，無菌條件下分離小鼠脾臟，剪碎脾臟并進行研磨，過200目細胞篩，采用RMPI1640培養基進行稀釋并離心，以細胞計數板進行計數，調整細胞濃度后加入96孔細胞培養板中，使每孔細胞的數量為5×105個。各組血清設置3個處理方式：空白處理（只加入細胞懸液）；LPS處理 （加入LPS終濃度為10μg·mL-1和細胞懸液）；ConA處理 （加入ConA終濃度為5μg·mL-1和細胞懸液）。每組設置6個復孔。細胞處理后，將培養板置于37℃含5%CO2的培養箱中繼續培養68 h。取出培養板，每孔加入MTT溶液20μL繼續培養4 h，加入DMSO 100μL混勻后，于490 nm波長處檢測各孔的OD值并計算細胞增殖率[10]。設定空白組脾淋巴細胞增殖率為100%，并計算各組小鼠淋巴細胞相對增殖率。

2.5 腹腔巨噬細胞吞噬能力

每組取10只小鼠，乙醚麻醉后固定于解剖盤上，腹腔注射無血清的RPMI1640培養基4 mL，輕輕撫摸小鼠腹部2 min，小心在小鼠腹部剪口，移液器吸出培養液于無菌離心管中，2 000 r·min-1離心15 min，棄去上清液，細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸，以細胞計數板計數，加入96孔培養板中，使得每孔的細胞數量為1×105，培養板置于37℃含5%CO2的培養箱中培養4 h貼壁，加入MTT 20μL，繼續培養4 h，每孔加入10%HCL-SDS 100μL，繼續培養8 h，于490 nm波長處測定OD值并計算吞噬指數。

2.6 小鼠血清IL-2、IL-4和IFN-γ水平檢測

取“2.2”中分離得到的各組小鼠眼球血的血清，按照Elisa試劑盒說明書進行IL-2、IL-4和IFN-γ水平檢測。

2.7 統計學方法

實驗計量資料采用均數±標準差 （x±s）表示，SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析，Student-Newman-Keuls檢驗進行組間比較。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結 果

3.1 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠體重及臟器指數的影響

造模后觀察到小鼠精神萎靡、毛發稀疏和攝食量減少的現象，表明環磷酰胺能夠造成小鼠免疫器官萎縮，免疫能力下降，免疫抑制小鼠模型建立成功。與空白組相比，模型組、香菇多糖組和潞黨參口服液組小鼠體重均顯著下降（P＜0.05），模型組小鼠脾臟指數和胸腺指數顯著下降（P＜0.01）。與模型組相比，潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2 g·kg-1）小鼠體質量、胸腺指數和脾臟指數均顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，潞黨參口服液能夠促進免疫抑制小鼠免疫器官的發育，增強免疫能力。見表1。

表1 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠體重及臟器指數的影響（±s，n=10）

表1 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠體重及臟器指數的影響（±s，n=10）

脾臟指數/%空白組 - 34.26±4.89 0.79±0.16 0.18±0.04模型組 - 24.38±2.06## 0.46±0.09## 0.11±0.03##香菇多糖組 0.2 30.61±3.27** 1.33±0.14**0.25±0.05**3.3 26.47±2.73 0.68±0.11* 0.15±0.04 6.6 27.79±3.35* 0.93±0.19**0.19±0.09**13.2 28.66±3.82** 1.16±0.23** 0.22±0.08**注：與空白組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。組別 劑量/g·kg-1 體重 胸腺指數/%潞黨參口服液組（低）（中）（高）

3.2 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠血清溶血素水平的影響

與空白組相比，模型組血清溶血素水平顯著降低（P＜0.01）。血清溶血素水平是評價機體免疫能力的重要指標，結果表明，免疫抑制劑環磷酰胺能夠降低血清溶血素水平，對小鼠的免疫能力產生抑制作用。給予香菇多糖和潞黨參口服液治療后，香菇多糖組、潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2 g·kg-1）小鼠血清溶血素水平顯著提高，且高劑量組（13.2 g·kg-1）的血清溶血素水平高于陽性藥香菇多糖組，結果提示，潞黨參口服液能夠增加免疫抑制小鼠的血清溶血素水平，增強免疫功能。見表2。

表2 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響（±s，n=10）

表2 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響（±s，n=10）

潞黨參口服液組組別 劑量/g·kg-1 血清溶血素（HC50）空白組 - 15.58±3.37模型組 - 8.85±2.16##香菇多糖組 0.2 12.37±3.58**3.3 9.94±2.89 6.6 10.64±3.05**13.2 13.08±3.29**（低）（中）（高）注：與空白組相比，##P＜0.01；與模型組相比，**P＜0.01。

3.3 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠淋巴細胞增殖的影響

經ConA與LPS分別誘導后，模型組脾T、B淋巴細胞增殖顯著降低，與空白組相比差異具有統計學意義。與模型組相比，香菇多糖和潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2 g·kg-1）ConA 誘導的 T 淋巴細胞增殖顯著 （P＜0.01）；LPS誘導的B淋巴細胞的增殖顯著（P＜0.01）。見表 3。

3.4 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬指數的影響

與空白組相比，模型組腹腔巨噬細胞吞噬指數顯著降低；與模型組相比，香菇多糖和潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2 g·kg-1）腹腔巨噬細胞吞噬指數顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），提示潞黨參口服液能夠增強小鼠非特異性免疫吞噬能力。見表4。

表3 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響（±s，n=6）

潞黨參口服液組組別 劑量/g·kg-1 T淋巴細胞/% B淋巴細胞/%空白組 - 100.00±11.26 100.00±12.48模型組 - 40.28±7.74## 45.33±8.15##香菇多糖組 0.2 117.48±12.15** 106.27±10.37**3.3 45.19±7.29 59.60±9.62*6.6 75.56±9.36** 78.82±9.92**13.2 92.18±10.26** 94.59±11.47**（低）（中）（高）注：與對照組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

表4 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬指數的影響（±s，n=10）

表4 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠巨噬細胞吞噬指數的影響（±s，n=10）

潞黨參口服液組組別 劑量/g·kg-1 巨噬細胞吞噬指數空白組 - 1.51±0.72模型組 - 1.26±0.48##香菇多糖組 0.2 2.36±0.81**3.3 1.41±0.72 6.6 1.92±0.93*13.2 2.29±0.97**（低）（中）（高）注：與對照組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.5 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠IL-2、IL-4和IFN-γ的影響

與空白組相比，模型組血清中IL-2、IL-4和IFN-γ均顯著下降。經香菇多糖和潞黨參口服液治療后，香菇多糖和潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2g·kg-1）血清中 IL-2、IL-4 和 IFN-γ 均顯著增加（P＜0.01），結果提示，潞黨參口服液能夠增強免疫抑制小鼠血清中免疫因子的水平，增強免疫作用。見表5。

表5 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4和TNF-α 的影響（±s，n=10）

表5 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4和TNF-α 的影響（±s，n=10）

IFN-γ/pg·L-1空白組 - 150.94±21.84 71.75±11.28 318.27±47.64模型組 - 96.48±17.62##41.42±7.93##209.35±26.49##香菇多糖組 0.2 137.23±19.80**83.69±13.21**330.26±51.74**3.3 105.19±16.74 60.94±12.89*266.49±38.32*6.6 108.37±18.46**74.37±11.28**300.34±47.27**13.2 119.04±20.37**78.65±10.03**328.16±42.93**組別 劑量/g·kg-1 IL-2/pg·L-1 IL-4/pg·L-1潞黨參口服液組（低）（中）（高）注：與空白組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討 論

環磷酰胺、長效類糖皮質激素（氫化可的松、地塞米松等）、長春新堿等是構建免疫缺陷型動物的常用造模劑。其中，環磷酰胺是一種烷化劑類細胞毒性藥物，能夠破壞DNA結構，阻斷復制，殺傷快速分裂的免疫細胞，抑制動物的體液免疫和細胞免疫，造成動物免疫抑制[11，12]。本研究采用連續3天腹腔注射50 mg·kg-1環磷酰胺構建免疫抑制小鼠模型，小鼠成模后出現蜷縮弓背、活動減少、不思飲食、毛發稀疏和體重減少等特征。小鼠解剖后，觀察發現與正常小鼠相比，模型小鼠脾臟和胸腺明顯萎縮，這與其他文獻的報道相一致[7]，可以判定環磷酰胺制備的免疫缺陷型小鼠模型成功。

脾臟和胸腺含有大量的免疫細胞，是機體最主要的免疫器官，其臟器系數能一定程度上反映機體的免疫能力和狀態。實驗中通過對小鼠的脾臟和胸腺系數進行檢測，結果發現，免疫抑制模型小鼠在接受潞黨參口服液治療后，其臟器指數明顯升高，表明潞黨參口服液能夠促進免疫抑制小鼠免疫器官的發育，增強免疫功能。同時，在血清溶血素形成實驗中，綿羊紅細胞致敏小鼠后，小鼠會產生相應的抗體即溶血素，反映了機體的特異性免疫水平。本實驗結果表明，潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2 g·kg-1）血清溶血素水平顯著升高，提示了潞黨參口服液能夠對免疫缺陷小鼠特異性免疫水平起到促進作用。

淋巴細胞是機體免疫系統的基本單位，是機體免疫應答的主要承擔者，其細胞數量能一定程度上反映機體的免疫應答能力和水平[13，14]。脾淋巴細胞增殖能力和功能是評價機體免疫能力的重要指標。在本研究中發現，潞黨參口服液能夠顯著促進LPS誘導的B淋巴細胞增殖和ConA誘導的T淋巴細胞增殖，同時也能夠增加巨噬細胞的吞噬指數，表明潞黨參口服液對環磷酰胺所致的小鼠淋巴細胞增殖減少和吞噬功能降低有一定的恢復作用。

除免疫細胞之外，血液中的免疫因子在機體免疫反應中也具有極其重要的作用[15]。IL-4主要由活化Th2細胞所分泌，具有活化B淋巴細胞并促進其增殖產生抗體的作用；IL-2和IFN-γ主要由Th1細胞產生，IL-2在維持T細胞的分裂增殖，誘導多種免疫細胞的分化和增殖方面具有重要作用；IFN-γ具有直接促進T、B細胞分化成熟，并促進巨噬細胞吞噬功能的作用。本研究結果表明，在環磷酰胺建模小鼠血清中，IL-4、IL-2和IFN-γ因子的水平明顯降低，潞黨參口服液能夠顯著增加小鼠血清中IL-4、IL-2和IFN-γ因子的水平，表明潞黨參口服液能夠提高免疫抑制小鼠的免疫能力。

綜上所述，潞黨參口服液可以通過促進免疫器官的發育、免疫細胞增殖和提高免疫因子水平，共同對免疫抑制小鼠產生一定的調節作用。因此，潞黨參口服液具有免疫增強的作用，值得為后續臨床和實驗研究提供參考。