卡介菌-多糖核酸對哮喘小鼠淋巴細胞CD4+CD25+調節性T細胞的影響

姜華 賴克方 南巖東 金發光

1空軍軍醫大學唐都醫院呼吸與危重癥醫學科,西安710038;2廣州醫科大學第一附屬醫院 廣州呼吸健康研究院510120

卡介菌多糖核酸 (bacillus calmette-guerin polysaccharide nucleotide,BCG-PSN)是BCG經過滅活后制成的一種免疫制劑,具有多種免疫活性[1-2],通過動物模型及臨床觀察均證實其對支氣管哮喘 (哮喘)有一定的防治作用[3-5],但其具體作用機制尚不清楚。CD4+CD25+調節性T細胞(CD4+CD25+Treg)具有免疫無能性和免疫抑制性的一類細胞,尤其是CD4+CD25+foxp3+T細胞與哮喘誘導免疫耐受密切相關[6],本研究通過觀察BCG-PSN對哮喘小鼠脾臟淋巴細胞中CD4+CD25+Treg細胞數量及功能的影響,為其防治哮喘提供詳實的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 Balb/c小鼠 (購自廣東省實驗動物中心)5～6周齡,體質量16～18 g,雌性。飼養在廣州呼吸疾病研究所SPF級動物房。卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)為美國Sigma公司產品,佐劑Al(OH)3為美國Sigma公司產品。BCG-PSN購自醫院藥房 (國藥準字92S020100,中國湖南斯奇生物制藥有限公司生產)。小鼠有創肺功能儀為美國Buxco公司產品。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養基、胎牛血清FCS均購自GIBCO公司,EZ-SepTMMouse 1×淋巴細胞分離液購自深圳達科為公司,FITC標記的抗CD4抗體、PE標記的抗CD25抗體、PE-cy5標記的抗foxp3抗體、PE標記的抗CTLA-4抗體及同型對照均購自美國eBioscience公司,IL-10、轉化生長因子 β (transforming growth factor-β,TGF-β)酶聯免疫吸附試驗 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自德國Bender公司,Trizol抽提試劑購自美國Invitrogen公司,real-time試劑盒 (DDR037,DDR041)購自日本Takara公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物致敏、激發 研究分為對照組、哮喘組和BCG-PSN干預組。每組各10只小鼠,以OVA首次致敏為第0天,在第0、7、14天時腹腔注射OVA(0.01%OVA,0.2 ml/只)致敏,第28、29、30天給予OVA(0.4%OVA,50μl/只)滴鼻激發,1次/d。正常組在每次給藥時間點給予相應劑量的生理鹽水。BCG-PSN干預劑量為20μg/只,體積為60μl,首次致敏前7 d腹腔注射干預,動物造模干預流程見圖1。

1.3.2 氣道反應性檢測 氣道反應性檢測各組在末次激發后48 h,用美國Buxco公司的有創氣道阻力與肺順應性檢測系統檢測小鼠的肺阻力 (lung resistance,RL),測定10μl倍增濃度的乙酰甲膽堿 (methacholine,Mch)霧化激發后RL的變化,激發濃度由低到高,依次為0、3.12、6.25、12.50、25.00和50.00 g/L,記錄各濃度級Mch激發下的RL平均值。當前激發濃度肺阻力/生理鹽水時肺阻力的比值 (RL/NS)作為小鼠氣道反應性的評價指標。Han 等[7]報道,本研究評價氣道反應性包括以下兩個方面：(1)與哮喘組相比可以顯著降低氣道反應性 (P＜0.05)的激發濃度;(2)氣道反應性升高為基值2 倍時的 Mch 激發濃度,值越小,氣道敏感性越高。

圖1 研究中動物致敏、激發、BCG-PSN 干預流程

1.3.3 BALF 中EOS%分析 在實驗流程第32天,小鼠行氣道反應性檢測后麻醉,仰臥位,行氣管插管,以0.8 ml PBS灌洗3次,回收率在80%以上。4℃,1 500×g離心10 min,沉淀涂片并行HE染色,連續計數200個細胞并計其中EOS的個數,計算EOS百分比。

1.3.4 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備 小鼠無菌取脾,在60 mm 培養皿中加入3 ml EZ-SepTMMouse 1×淋巴細胞分離液,按照說明書制備脾臟淋巴細胞懸液,加入RPMI1640 培養液,臺盼藍染色證實活細胞＞95%,計數約為2×107/ml,37 ℃,5%CO2孵箱孵育72 h。

1.3.5 ELISA 檢測脾淋巴細胞懸液CD4+CD25+Treg細胞/CD4+T 細胞比例 取上述懸液200μl(細胞總數約1×106個),加入 CD4-FITC 及CD25-PE 同型對照及抗體,室溫,避光孵育30 min,加入2 ml 1×PBS,重懸混勻,2 000×g離心10 min,4℃避光孵育30 min,洗滌后緩沖液重懸細胞后ELISA 上機檢測。

1.3.6 Realtime-PCR 檢測 脾臟淋巴細胞中foxp3 m RNA 及CTLA-4 mRNA 的表達 取前述所得脾淋巴細胞,按照Trizol說明書提取RNA,稀釋50倍后經紫外分光光度計測260 nm OD 值,計算RNA 濃度,按照說明書采用一步法進行逆轉錄反應,獲得cDNA,以此為模板進行real-time-PCR 反應,各個反應物引物：按參考文獻 [8-9],foxp3 上 游 引 物：5'-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3',下游引物：5'-TTCTCACAACCAGGCCACTTG-3';CTLA-4 上游引物：5'-GGGCTGGGTCTTTACACTCATTTT-3',下游引物：5'-CTTCCTGTGGCATTAACTTTGTGT-3'。 反應體系：以94 ℃ 10 min,94 ℃ 15 s,56 ℃ 20 s,72 ℃15 s的方式循環45次,最后55 ℃記錄熔解曲線,采用2ΔCt方法計算foxp3、CTLA-4 基因的表達水平。

1.3.7 ELISA 檢測脾淋巴細胞上清液中IL-10和TGF-β的含量 具體操作見相應說明書。

2 結果

2.1 氣道反應性

2.1.1 RL/NS 哮喘組在 Mch 各個激發濃度3.12、6.25、12.50、25.00和50.00 g/L RL/NS均明顯高于正常組,說明該模型小鼠具備氣道高反應性,BCG-PSN干預組在 Mch 激發濃度為3.12、6.25、12.50 g/L時可顯著降低RL/NS,見圖2、表1。

圖2 BCG-PSN 腹腔注射干預對哮喘小鼠RL/NS的影響

2.1.2 氣道反應性升高為基值2倍時的Mch激發濃度 正常組明顯高于哮喘組,說明造模小鼠氣道敏感性高,BCG-PSN 干預組 Mch 激發濃度為(12.61±5.33)g/L,與哮喘組 (7.73±2.69)g/L相比,差異有統計學意義 (P＜0.01),見圖3。

表1 BCG-PSN 腹腔注射干預對哮喘小鼠RL/NS的影響 (g/L,±s)

表1 BCG-PSN 腹腔注射干預對哮喘小鼠RL/NS的影響 (g/L,±s)

注：RL/NS為當前激發濃度肺阻力與生理鹽水激發時肺阻力的比值;Mch為乙酰甲膽堿;BCG-PSN 為卡介菌多糖核酸;與哮喘組比較,a P ＜0.05

組別 鼠數Mch激發濃度3.12 6.25 12.50 25.00 50.00正常組 10 119.34±8.45a 148.10±17.56a 186.54±21.96a 309.06±72.26a 447.84±70.21a哮喘組 10 199.76±29.13 259.10±35.91 373.24±71.56 497.24±153.68 576.24±153.57 BCG-PSN 干預組 10 136.44±12.73a 212.59±26.56a 280.26±45.11a 411.94±68.56 542.89±81.30

圖3 各組氣道反應性升高為基值2倍時的Mch激發濃度

2.1.3 氣道炎癥 哮喘小鼠BALF中EOS(47.61±6.91)%,明顯高于正常組 (0.19±0.03)%,說明造模小鼠具備高EOS 為特征的氣道炎癥。BCGPSN 干預組BALF中EOS占 (36.28±10.01)%,與哮喘組相比,差異有統計學意義 (P＜0.01),見圖4。

圖4 BCG-PSN 對哮喘小鼠BALF中EOS%的影響

2.1.4 BCG-PSN 對哮喘小鼠脾臟淋巴細胞CD4+CD25+Treg 細胞數量的影響 哮喘組CD4+CD25+Treg 細 胞/CD4+T 細 胞 比 例 (3.71±2.19)%明顯低于正常組 (6.44±1.16)% (P＜0.01),BCG-PSN 干預組為 (6.75±1.63)%與哮喘組相比差異有統計學意義 (P＜0.01),見圖5。

圖5 BCG-PSN 對哮喘小鼠脾臟淋巴細胞CD4+CD25+Treg細胞/CD4+細胞比例的影響

2.1.5 BCG-PSN 對哮喘小鼠脾臟淋巴細胞foxp3 m RNA 及 CTLA m RNA 的 影響

2.1.5.1 哮喘組foxp3 m RNA 及CTLA m RNA的相對表達量 哮喘組小鼠脾臟淋巴細胞foxp3 m RNA 的表達量僅為正常組的 (0.23±0.21)倍,而CTLA-4m RNA 的表達量為正常組 (0.65±0.31)倍,提示哮喘組小鼠脾臟淋巴細胞foxp3 m RNA 及CTLA m RNA 表達明顯降低,見圖6。

2.1.5.2 BCG-PSN 干預對哮喘小鼠脾臟淋巴細胞foxp3 m RNA、CTLA-4 mRNA 的影響 BCGPSN 干預組小鼠脾臟淋巴細胞foxp3 m RNA 表達量是哮喘組的 (1.82±0.76)倍,差異有統計學意義 (P＜0.05),CTLA-4 m RNA 表達量是哮喘組的 (1.66±0.57)倍,差異有統計學意義 (P＜0.05),見圖7。

2.1.6 BCG-PSN 干預對哮喘小鼠脾淋巴細胞上清液IL-10、TGF-β的影響 哮喘小鼠脾臟淋巴細胞上清中IL-10、TGF-β 的含量明顯少于正常組。BCG-PSN組IL-10含量為 (210.32±88.23)ng/L,顯著高于哮喘組 (114.41±73.58)ng/L (P＜0.05)。BCG-PSN 組 TGF-β 含量 為 (487.66±32.57)ng/L, 顯著高于哮喘組(97.76 ±23.58)ng/L (P＜0.01),見表2。

圖6 哮喘組與正常組小鼠脾臟淋巴細胞Foxp3 mRNA 及CTLA-4 mRNA 的表達

圖7 BCG-PSN 干預對哮喘小鼠脾臟淋巴細胞foxp3 m RNA (A)、CTLA-4 m RNA (B)的影響

表2 BCG-PSN 干預對哮喘小鼠IL-10及TGF-β的影響 (ng/L,±s)

表2 BCG-PSN 干預對哮喘小鼠IL-10及TGF-β的影響 (ng/L,±s)

注：BCG-PSN 為卡介菌多糖核酸;TGF-β為轉化生長因子-β;與哮喘組比較,a P ＜0.05,b P ＜0.01

組別 鼠數 IL-10 TGF-β正常組 10 218.91±53.91a 549.66±261.41b哮喘組 10 114.41±73.58 97.76±23.58 BCG-PSN 干預組 10 210.32±88.23a 487.66±32.57b

3 討論

哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,以氣道高反應性和氣道炎癥為重要特征,可自然緩解或經治療后緩解,發病率呈增高趨勢[10-12]。2006年亞太哮喘見解與現實第2 階段調查結果顯示,亞太地區哮喘患者只有2.5%達到哮喘控制[13],CD4+CD25+Treg 細胞是一種具有免疫抑制及免疫調節作用的細胞,具有獨特的作用方式和功能特征,有可能在哮喘等變態反應性疾病和一些自身免疫性疾病的發病中起重要作用[14-15],大量動物試驗證實BCG[16-19]通過CD4+CD25+Treg細胞防治哮喘,但完整的BCG 因其成分復雜,且副作用大,無法直接用于臨床,BCG-PSN 是BCG經熱酚法去除蛋白后提取BCG-PSN,配以滅菌生理鹽水制成的以多糖成分為主的一種非特異免疫調節劑,多個研究[2-5]證實其對哮喘有保護作用,但具體作用機制仍未明確。

通過研究證實哮喘小鼠CD4+CD25+T 細胞數量明顯低于正常組,說明哮喘小鼠體內的CD4+CD25+Treg 的確存在數量上的缺陷,Fontenot等[20]發現,高表達foxp3 的轉基因小鼠CD4+CD25+Treg細胞數量明顯增加,foxp3敲除小鼠活化的CD4+細胞增多,卻缺乏獨立的CD4+CD25+Treg細胞,因而導致自身免疫性疾病的發生,此后多個研究[21-22]表明foxp3 是調控CD4+CD25+Treg細胞發育及啟動抑制功能的關鍵因子。通過real-time-PCR 測定了哮喘小鼠脾臟淋巴細胞中foxp3基因的表達水平,發現該基因的表達僅為正常組的23%左右,提示哮喘小鼠體內還存在著CD4+CD25+Treg的功能缺陷。BCG-PSN 干預可明顯提高CD4+CD25+Treg 細胞/CD4+T 細胞比例,上調哮喘小鼠foxp3 m RNA 的表達水平。因此說明BCG-PSN 干預顯著增加CD4+CD25+Treg細胞數量和功能。

CD4+CD25+Treg細胞可通過CTLA-4介導的細胞接觸依賴機制發揮其免疫抑制功能,從而阻止哮喘的發生。CTLA-4是CD4+CD25+Treg細胞上膜分子,是T 細胞活化所需的協同刺激分子CD28的同源異構體,CTLA-4對效應性T 細胞的B7-1分子的親和力比CD28更強,抑制效應性T 細胞的增殖和活化,從而調節哮喘等疾病的免疫失衡[23-24]。說明CTLA-4對于誘導CD4+CD25+Treg細胞的抑制功能是十分重要的;研究結果顯示哮喘組CTLA-4m RNA 的水平為正常組的65%左右,說明哮喘小鼠存在CTLA-4mRNA 低表達,而BCG-PSN 干預組的CTLA-4m RNA 表達水平與哮喘組相比明顯增高,說明BCG-PSN 可上調CTLA-4m RNA 的表達,并通過CTLA-4 介導的細胞-細胞接觸抑制從而對哮喘小鼠產生保護作用。

此外CD4+CD25+Treg細胞也可通過分泌細胞因子 (IL-10、TGF-β)而介導抑制效應[25]。研究顯示哮喘組中IL-10及TGF-β的分泌水平明顯低于正常組,BCG-PSN 干預組的IL-10及TGF-β的分泌水平明顯高于哮喘組,說明BCG-PSN 可能通過分泌抑制性細胞因此IL-10 及TGF-β從而產生對哮喘小鼠的保護作用。同時,除了CD4+CD25+Treg細胞外,機體內還存在著一類能分泌IL-10的Tr1 (抑制由Th1介導的自身免疫反應的T 細胞)[26]和能分泌TGF-β的Th3[27]。因此,本實驗IL-10和TGF-β可能是多來源的,提示可能BCG-PSN 還可通過其他機制如樹突狀細胞、Tr1、Th3等發揮免疫調節作用。

綜上所述,BCG-PSN 干預可增加哮喘小鼠CD4+CD25+Treg細胞數量及功能,具體可能通過促進IL-10、TGF-β等抑制性細胞因子的分泌及CTLA-4介導的細胞-細胞接觸抑制機制誘導免疫耐受,從而降低哮喘小鼠的氣道反應性和氣道炎癥。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突