日光溫室栽培模式下不同種質來源人參單體皂苷及氨基酸對比分析

常思佳，寧 雪 ，王日明，楊錄軍 ，任躍英 *（.吉林農業大學中藥材學院，長春308；.吉林紫鑫紅石種養殖有限公司，通化3535）

東北地區是人參的道地藥材產區，學者們對各類新品種人參的育種研究付出了極大的努力。人參皂苷作為人參中最主要的活性成分，皂苷種類、皂苷含量成為人參質量評價至關重要的標準，人參皂苷含量的高低，直接關系到人參質量的優劣[1]。而氨基酸對人參植物體增強黑斑病抗病性[2]、調節代謝功能有[3]重要作用。

本實驗樣品于吉林省通化市東昌區金廠鎮龍頭村生產基地采集，供試人參全部栽培于基地日光溫室內，為首次采用日光溫室栽培的人參。日光溫室是我國北方特有的一種栽培模式[4～5]。該地區日光溫室由墻體、支撐骨架及藍色棚膜材料組成，于2014年4月正式于該基地開始首次規模栽培人參。實驗對該栽培模式下6種種質來源的4年生人參利用高效液相色譜法進行20種單體皂苷的提取測定，利用氨基酸自動分析儀（茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀）對16種人參氨基酸含量的進行測定，以區別其質量的優劣及是否達到藥典標準，并進一步探討其藥食同源產品化的價值。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗地區種質資源來源情況

野山參I為引種并繁育的第3代品種。第1代2004年7月采于長白山原始森林野生山參，并于2005 年 4 月種植于北崗鎮 (127°32′E，42°24′N， 海拔308m)；第2代于2008年7月采種子，于2009年4月繼續在北崗鎮種植；2013年7月采集第3代種子。

野山參II取自小興安嶺原始森林野山參的育種種質，為引種并繁育的的第1代品種。

林下參I為通化地區二馬牙林下參采種后引種并繁育的第1代。

林下參II為通化地區長脖林下參采種后引種并繁育的第1代。

園參I為引種并繁育的的大馬牙農家品種，作為對照實驗。

園參II為大馬牙與二馬牙雜交的育種后代品系并進行選育繁育，作為對照試驗。

1.1.2 實驗地區及日光溫室種植的基本情況

本實驗在吉林省通化市東昌區金廠鎮龍頭村生產基地進行，基地地處北緯 41°36′東經 126°0′，海拔500m。基地采取混凝土墻體、鋼管結構支撐架及藍色棚膜組成的半拱形日光溫室生產模式，構架長度70 m，跨度8 m，頂寬4 m，墻高3.5 m。1.1.1中6種種質資源均于2014年4月正式開始在該基地日光溫室內規模播種繁育。溫室內參床垂直于墻體排列，參床高30～40 cm，寬 1.5 m，長 7.5 m，床間作業道寬 30 cm。播種方式為直播，密度為5′5點播，每平方米400粒，留種田出苗后根據出苗情況進行補苗、間苗管理，保證每行有12～13株苗。由于該栽培模式特有的各自獨立屬性，基地對于不同種質人參的種源保存、花粉隔離具有顯著優于傳統伐林栽參、農田栽參的模式。

1.1.3 實驗樣品選取

樣品于2017年9月26日在田間進行采集，全區20%左右植株進入自然枯萎期，判定為該區域人參的枯萎期初期。經吉林農業大學任躍英教授鑒定，供試的6個品系均為4年生人參，本實驗取6個品系的人參樣品各5株進行對比及分析。

1.2 實驗儀器

表1 -1主要儀器Tab.1-1 The main instruments

2 實驗方法

2.1 人參皂苷的測定

本實驗對6種種質來源人參的20種單體皂苷：Rg1，Re，Rf，Rb1，Rg2，Rc，Rh1，Rb2，Rb3，F1，Rd，Rk3，F2，Rh4，Rg3，原人參三醇，Compound K，Rg5，Rh2，原人參二醇利用HPLC色譜法進行測定。

2.1.1 樣品溶液的制備

取6種不同不同種質來源的人參各5株，陰干后打粉，過40目篩后，精密稱取待測人參樣品粉末各0.5 g，分別置于10 mL離心管中，每管加入5 mL色譜甲醇溶液，稱取離心管質量并記錄，用封口膜密封，超聲提取45 min，靜置過夜。第二天再次稱取離心管質量，按所記錄的質量用色譜甲醇溶液補足，二次超聲提取 45 min，離心 15 min（5 000 rmin-1），取上清液并過0.45 μm濾膜，所得即為樣品溶液。

2.1.2 人參皂苷的測定及統計

HPLC條件參照楊艷文等[6]所建立的：同時測定人參的20種單體皂苷的方法。進樣量20 μL。

測得數據采用SPSS 22.0軟件進行分析統計，得出結果。

2.2 人參氨基酸的測定

本實驗采用氨基酸分析儀（茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀）對種人參的16種氨基酸：天門冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）進行測定。測定方法參照《中華人民共和國國家標準 （食品安全國家標準 食品中的氨基酸的測定）》。

2.2.1 樣品溶液的制備

取6種不同不同種質來源的人參各5株，陰干后打粉，根據蛋白質含量分別稱量（約1 g），置于水解管中，加入15 mL 6 molL-1鹽酸溶液、苯酚3～4滴。將水接管放入冷凍機中冷凍5 min，接入真空泵抽氣管抽至真空，然后充入氮氣，重復抽充3次后在氮氣狀態下封口。將水解管放在110℃±1℃的鼓風恒溫箱中水解22 h后取出，冷卻至室溫。將水解液過濾至50 mL容量瓶內，用蒸餾水沖洗水解管，所有溶液一同移入容量瓶，最后用水定容至刻度，振蕩搖勻。精確吸取1 mL濾液至15 mL試管，用平行蒸發儀在40℃～50℃加熱減壓，干燥后殘留物用1～2 mL水溶解，再減壓干燥，蒸干。用1～2 mL pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖液加入到干燥后的試管內，混勻后過0.22 μm濾膜，即為待測溶液。

2.2.2 氨基酸的測定及統計

色譜條件：磺酸型陽離子樹脂；檢測波長：570 nm和440 nm。以外標法通過峰面積計算樣品測定液中氨基酸的濃度。

3 結果與分析

3.1 20種單體皂苷測定結果

3.1.1 色譜峰歸屬

如圖1-1所示，20種人參皂苷在該條件下均得到良好的分離。

3.1.2 線性關系考察

圖1 -1人參20種皂苷的標準品色譜圖Fig.1-1 HPLC chromatograms of mixed standard solution

表1 -2人參皂苷的回歸方程Table1-2 Regression equations with correlation coefficients for ginsenosides

如表1-2所示，將皂苷質量(y)對峰面積的積分值(x)進行作圖，得到線性回歸方程。20種單體人參皂苷在1.96～20.80 μg范圍內呈現良好的線性關系 （r＞0.999）。

3.1.3 單體皂苷含量測定結果

供試的6種不同種質來源人參均檢測出20種單體皂苷中的13種，如表1-3、圖1-2所示。其中，野參I的總皂苷加和值顯著高于其他品系 (P＜0.05)，達到2.565 1%。總皂苷含量從高到低依次為：野參I＞野參 II＞林下參 II＞林下參 I＞園參 I＞園參 II。 在 Rg1 含量組中，野參I顯著高于其他品系(P＜0.05)，且野參II顯著高于林下參II；Re含量野參II均顯著高于其他品系 (P＜0.05)；Rf含量野參I顯著高于其他品系 (P＜0.05)；Rb1含量林下參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；Rg2含量野參II與林下參I顯著高于林下參II(P＜0.05)；Rc 含量野參 II顯著高于園參品系(P＜0.05)；Rb2含量野參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；Rb3含量野參I顯著高于林下參及園參品系(P＜0.05)；Rd含量野參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；Rh4含量林下參I與園參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；Rg5含量野參I和林下參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；Rh2含量園參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；原人參二醇含量林下參II顯著高于其他品系(P＜0.05)。根據2015版《中國藥典》規定：按人參干燥品計算，含人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總量不得少于30%，人參皂苷Rb1不得少于0.20%。所有測試樣品均達到藥典標準。

表1 -3 6種種質來源人參皂苷含量Table1-3 Ginsenosides Content of ginseng from six germplasm sources %

圖1 -2 6種種質來源人參20種皂苷色譜圖Fig.1-2HPLCchromatogramsof20saponinsfrom6germplasmsourcesofginseng

3.2 16種氨基酸測定結果

3.2.1 色譜峰歸屬

圖1 -3人參16種氨基酸的標準品色譜圖Fig.1-3 Standard map of 16 amino acids of ginseng

3.2.2 氨基酸含量測定結果

供試的6種不同種質來源人參所檢測出的16種氨基酸如表1-4、圖1-4所示。表中所示蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸的含量百分比，野參I均顯著高于其他品系(P＜0.05)；天門冬氨酸含量野參II與林下參I顯著高于其他品系(P＜0.05)；谷氨酸含量林下參II顯著高于其他品系(P＜0.05)；丙氨酸含量野參I和林下參II顯著高于其他品系(P＜0.05)；亮氨酸含量野參I顯著高于林下參II和園參I、II(P＜0.05)；精氨酸含量野參II顯著高于其他品系(P＜0.05)。其中，野參I的氨基酸總加和值顯著高于其他品系(P＜0.05)。

表1 -4 6種種質來源人參氨基酸含量Table1-4 Amino acid content of ginseng from six germplasm sources%

圖1 -4 6種種質來源人參16種氨基酸色譜圖Fig.1-416aminoacidchromatogramsof6germplasmsourcesofginseng

4 討論

李海軍[7]等、鐘方麗[8]、張蘭蘭[9]從林下山參中分離出20多種皂苷類化合物。通過不同種質人參的皂苷成分含量對比研究發現，林下山參總皂苷含量(4.6%)低于野山參(7.2%)，但高于園參(3.8%)[10]，林下山參中單體人參皂苷Re含量相對較高，與野山參和園參有顯著性差異(P＜0.01)，平均含量為 5.042 mgg-1[11，12]。 人參中富含多種氨基酸，其種類和數量因人參品種、參齡、產地、以及人參部位而異，其中人參根所含的氨基酸主要有精氨酸、賴氨酸、丙氨酸等20多種。目前，氨基酸的含量已作為衡量人參產品質量的指標之一[13]。張晶等[14]利用HPLC色譜法測定人參根渣中的氨基酸含量。得出結論：人參樣品中含有15種氨基酸，氨基酸總量達到19.08%，其中6種人體必需氨基酸總量達到9.38%，占氨基酸總量的49.18%。

人參皂苷作為人參具有主要藥用價值的有效成分，其含量的高低直接決定了人參的質量及品質，而人參中氨基酸的含量，對于人參作為藥食同源產品化進程的推進具有至關重要的作用。本實驗通過對6種種質來源人參皂苷、氨基酸的測定，可看出：在日光溫室栽培模式下，各品系人參的皂苷、氨基酸含量均呈現出較高的數值，且具有較大的差異。

從20種單體皂苷的測定結果可見，供試人參均達到2015版《中國藥典》標準。其中，野參I的皂苷總加和值顯著高于其他品系，但各單體皂苷數值較為平均，在《中國藥典》所規定的 Rg1、Re、Rb1 含量中，只有Rg1含量顯著高于其他品系，而野參II總皂苷含量僅次于野參I，Re、Rb1含量顯著高于其他參種，可見，供試的兩個野參品系人參均呈現較高的質量。林下參品系和園參品系多數皂苷含量差異不顯著，大多呈現林下參品系＞園參品系的趨勢，或由于林下參和園參共同馴化多年所致，還有待進一步研究。皂苷含量的數值表明，該地區以日光溫室栽培模式栽培人參較為合理，且野參品系有較高的數值表現，具備深入研究與推廣的價值。

從本實驗所測定的16種氨基酸含量可見，供試人參含有的氨基酸較為豐富，含有8種人體必需氨基酸中的7種，且含量較高。各品系人參氨基酸含量的高低各有差異，野參I多數氨基酸含量指標均顯著高于其他品系，總加和值也顯著優于其他品系，具備了推進人參藥食同源產品化的基礎。各品系的氨基酸總含量從高到低依次為：野參I＞野參II＞林下參II＞林下參I＞園參II＞園參I。林下參品系與園參品系總加和值的差異并不顯著。另一方面，研究發現，人參氨基酸對于人參黑斑病具有明顯的抑制作用[2]，據此，本實驗結果也為該栽培模式下不同種質來源人參的抗逆性也提供了研究基礎，有待進一步的研究求證。