MMP-2、MMP-9與腦動脈畸形的相關性研究*

毛中臣，付志新，孫 永，趙 燕，陳卡佳

開封市中心醫院 神內重癥科(開封 475000)

腦血管畸形是一種腦血管先天性、非腫瘤性血管疾病，主要表現為腦局部血管數量和結構異常，并引起腦血流異常。近年來人們對腦血管畸形的認識及治療方法的研究越來越深入。腦動靜脈畸形常發生于20～40歲青年患者，研究[1-2]發現男女發病率相當。腦動靜脈畸形患者主要癥狀有癲癇、出血、頭痛及其他局灶性神經功能障礙，癥狀可單獨存在，也可合并發生[3-7]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一組依賴于鋅、鈣離子的蛋白水解酶，能夠促進細胞外基質的降解和重構。MMPs能夠降解構成細胞外基質，主要包括膠原蛋白、非膠原蛋白和彈性蛋白，因此MMPs對血管重塑起關鍵作用。其中，基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)與缺血性腦損傷的發生、發展關系密切[8-10]。MMP-2又稱明膠酶A，大量研究[11-13]表明，MMP-2是細胞外基質合成和降解代謝過程中的關鍵因子。MMP-9是MMPs家族中重要的成員之一，其能夠降解細胞外基質中的Ⅳ型膠原蛋白，是腦基底膜降解過程中的重要因素之一[14]。本研究主要對MMP-2和MMP-9在腦動脈畸形患者中的表達進行研究，以期為腦動脈畸形的治療提供新的靶點和治療方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月至2018年6月開封市中心醫院收治的腦動脈畸形患者30例為觀察組，納入標準為：1)患者自愿參加試驗，愿意隨訪者；2)臨床資料完整，實驗室檢查齊全；3)首次確診為腦動脈畸形者。排除標準為：1)重要臟器功能不全者，伴有其他自身免疫系統疾病者；2)臨床資料不完整缺項者；3)伴有血液系統、自身免疫系統疾病者；4)伴有高血壓、高血脂及糖尿病等血管疾病者。觀察組男16例，女14例；年齡25～68(42.7±8.1)歲。選取同期腦外傷非血管性疾病患者18例為對照組，均經CT及MRI證實為非血管性疾病的外傷患者，排除標準：無高血壓、高血脂及糖尿病等血管疾病病史。對照組男8例，女10例；年齡23～61(45.5±7.8)歲。收集觀察組和對照組患者的血清和手術切除的標本。本研究經開封市中心醫院倫理委員會審核同意。兩組患者在性別、年齡方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 試劑材料

BCA蛋白定量試劑盒、細胞裂解液(南通碧云天生物技術研究所)；MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗、HRP標記二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)；引物合成、逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(大連TaKaRa)；免疫組織化學染色試劑盒SP-9001(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清中MMP-2和MMP-9含量

觀察組與對照組患者均于清晨，空腹抽取3～5 mL靜脈血，離心機離心10 min(2 500 r/min)，離心半徑25 cm。小心吸取上層血清，立即存放于-20 ℃冰箱保存待用。采用ELISA法檢測血清中MMP-2和MMP-9的含量，實驗操作按照說明書操作，每個樣品重復檢測3次。

1.4 RT-PCR檢測MMP-2、MMP-9 mRNA在腦動脈標本中的轉錄水平

取材后部分標本置于-80 ℃保存待用，取各組標本樣品約50 mg，根據試劑盒中提供的方法提取待測組織中的總RNA，并檢測RNA的質量濃度和質量分數，以吸光度值A260/A280比值為1.8～2.0時視為合格，按照試劑盒說明書操作方法進行逆轉錄，然后加入引物(表2)，PCR定量檢測mRNA的轉錄水平，選取GAPDH作為內參，反應條件為：94 ℃ 5 min；然后94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，總共擴增30個循環；72 ℃ 5 min。

表2 RT-PCR引物序列

1.5 Western blot檢測MMP-2和MMP-9在腦動脈標本中的表達

分別從兩組中取樣約50 mg，加入含蛋白酶抑制劑的組織裂解液，置于冰上充分研磨。4 ℃，離心速度2 500 r/min,離心半徑25 cm,離心15 min后，取上清后測定蛋白濃度進行電泳和轉膜，然后用5% BSA封閉，分別加入相應抗體，4 ℃過夜，加入二抗孵育2 h，用ECL顯影液暗室顯影，儀器掃描拍照，以GAPDH作為內參進行分析。

1.6 免疫組化檢測病理組織中p53蛋白的表達

取材后標本即以10%福爾馬林固定48 h，石蠟包埋，5 μm連續切片備用。按照免疫組織化學試劑盒說明書進行操作：石蠟切片脫蠟，3% H2O2進行內源性過氧化物酶活性滅活，然后熱修復，采用10%山羊血清進行封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，滴加二抗，孵育15 min，PBS沖洗，DAB顯色，顯微鏡下拍照。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，定性資料采取例數(%)描述，組間比較采用2檢驗或Fisher確切概率法；定量資料采用均數±標準差描述，組間比較采用t檢驗。檢驗水準α除特別說明外均設定為0.05。

2 結果

2.1 兩組血清中MMP-2和MMP-9含量比較

觀察組血清中MMP-2含量為(47.65±9.46)ng/mL，MMP-9為(56.54±10.63)ng/mL，含量均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表3 兩組血清中MMP-2和MMP-9含量

2.2 兩組MMP-2和MMP-9 mRNA轉錄水平比較

觀察組中MMP-2和MMP-9的mRNA轉錄水平均高于對照組，差異有統計學意義(MMP-2：t=6.657，P=0.003；MMP-9：t=7.126，P=0.009)(圖1)。

圖1 兩組血清中MMP-2和MMP-9轉錄水平比較

2.3 兩組MMP-2和MMP-9蛋白表達比較

與對照組相比，觀察組中MMP-2(0.817±0.032)和MMP-9(0.838±0.061)的蛋白表達高于對照組(MMP-2：0.087±0.011；MMP-9：0.093±0.028)，差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 Western blot檢測標本中MMP-2和MMP-9蛋白的表達

2.4 兩組標本中MMP-2和MMP-9蛋白表達

免疫組化結果顯示，褐色為陽性細胞，MMP-2和MMP-9在正常對照組僅見微量表達或不表達，而在觀察組標本組織中可見MMP-2和MMP-9表達升高(圖3)。

圖3 免疫組化法檢測標本中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(400×)

3 討論

MMPs主要由血管內皮細胞、單核細胞和平滑肌細胞產生，在體內能夠參與很多生理過程，主要包括胚胎發育、血管生成、傷口愈合和神經細胞的發育。其中MMP-2的底物主要包括彈性蛋白、明膠和Ⅴ型膠原，而且MMP-2的表達異常與腦血管畸形密切相關[15-17]。MMP-9是一種促炎蛋白酶，又稱Ⅳ型膠原酶，首先在體內以前體形式分泌，但沒有活性，然后經過特殊的蛋白酶或自由基激活才能發揮作用，其底物主要包括明膠、Ⅳ型膠原和彈性蛋白等[18]。研究[19]發現MMP-9的高表達能夠破壞血管內皮細胞外基質，這可能是促進畸形血管團生長的一個重要因素。

本研究結果顯示，觀察組患者MMP-2和MMP-9在血清中的水平均明顯高于對照組，并且觀察組中MMP-2和MMP-9在mRNA及蛋白表達水平上升高，免疫組化結果同樣證明了觀察組患者組織中MMP-2和MMP-9蛋白的表達率上升，即MMP-2 和 MMP-9 是調節細胞外基質動態平衡的明膠酶，其與顱內動脈瘤的發生和破裂關系密切。明膠酶MMP-2與MMP-9 對 ECM 具有破壞作用，其可降解構成 ECM 的主要組成成分，包括蛋白多糖、纖維連接蛋白和膠原，從而參與重建細胞外基質。MMP-2 和 MMP-9 的活性增加能夠破壞動脈基底膜的組成部分-IV 型膠原，進而打破了動脈壁的平衡機制，誘發動脈壁發生退行性變。

綜上所述，MMP-2和MMP-9在腦血管畸形的形成和發展中發揮重要作用，如果能夠調節局部MMP-2和MMP-9的含量，這可能成為新的治療腦血管畸形的方法。目前研究者能夠在體外制備MMP-2和MMP-9的特異性抑制劑，而且應用這些特異性抑制劑能夠抵抗MMP-2和MMP-9對細胞外基質的降解作用，MMP-2和MMP-9特異性抑制劑以后有可能成為治療腦血管畸形的藥物[20]。MMP-2和MMP-9既可作為腦血管畸形的診斷標志物，又可作為其治療靶點，調節MMP-2和MMP-9的表達有可能成為治療腦血管畸形新的方法。