CRM197重組慢病毒對前列腺癌PC-3細胞作用的初步研究*

劉 雙，李 艷，唐藝媛，曹 康，代呂霞△

1.成都醫(yī)學院 臨床醫(yī)學院(成都 610500)；2.成都醫(yī)學院 病原生物學教研室(成都 610500)

CRM197是白喉毒素突變體中的一種。由于錯義突變，CRM197細胞毒性明顯降低，但仍能抑制細胞蛋白質的合成，導致靶細胞死亡[1-4]。近年來有多項研究[1-2]表明，CRM197具有抗腫瘤作用。目前，CRM197蛋白治療卵巢癌和腹膜癌的研究已進入Ⅰ期臨床試驗階段[5]。復發(fā)性卵巢癌和腹膜癌患者腹壁皮下注射CRM197蛋白進行治療，結果顯示，CRM197治療效果良好，其療效與劑量存在正相關[6-7]。細胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機制之一，Caspase-9是分子量為46 KD細胞凋亡啟動因子，在凋亡信號傳導過程中先于其他蛋白酶被活化，繼而引起Caspase-3的活化。Caspase-3是分子量約為32 KD的細胞凋亡執(zhí)行因子，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。本研究通過觀察CRM197重組慢病毒對PC-3細胞生物學特性的影響，初步探討CRM197重組慢病毒抗前列腺癌的作用機制，為前列腺癌的治療提出新的構思與想法。

1 材料與方法

1.1 材料

PC-3細胞由成都醫(yī)學院科研中心保存，新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基購自HyClone，BCA蛋白定量試劑盒、Caspase-3、Caspase-9、GAPDH購自碧云天生物技術有限公司，PCDH-CRM197-copGFP重組慢病毒、CRM197多克隆抗體已由本課題組制備完成。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇 取出凍存的PC-3細胞，37 ℃融化后，轉移至15 mL離心管中。加入10%血清的DMEM培養(yǎng)液5 mL，1 000 r/min，離心半徑14 cm，離心5 min，小心棄上清。重新加入10%血清的DMEM培養(yǎng)液5 mL，輕輕吹打混勻后轉移至75 mL 細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組 空白對照組(Con組)：PC-3細胞，加入10%血清的DMEM培養(yǎng)液；空病毒組(EV組)：PC-3細胞，加入空載體病毒液(MOI=2)，感染24 h后，更換為10%血清的DMEM培養(yǎng)液；CRM197組(CRM197組)：PC-3細胞，加入CRM197病毒液(MOI=2)，感染24 h后，更換為10%血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.2.3 MTT實驗 當PC-3細胞生長狀態(tài)良好，達80%～90%融合時，0.25%胰酶進行消化。顯微鏡下觀察細胞收縮、變圓后，加入等量10%血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。輕柔吹打，1 000 r/min，離心半徑14 cm，離心5 min，棄上清。加入10%血清的DMEM培養(yǎng)液5 mL，輕柔吹打重懸細胞沉淀。按5×103/孔的密度接種于96孔板，每組設3個復孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，至細胞達30%～40%融合，進行相應組別處理，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每孔加入5 μL MTT，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱4 h。小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲亞砜(DMSO)，輕柔振搖10 min，酶標儀上測OD490。用不含細胞的空白孔調零，將Con組細胞存活率記為100%，分析EV組、CRM197組細胞存活率變化。實驗重復3次，取均值。

1.2.4 Hoechst染色 當PC-3細胞生長狀態(tài)良好，達60%～80%融合時，0.25%胰酶消化細胞。計數(shù)后按5×105/孔的密度接種6孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達40%～50%，分別進行Con組、EV組和CRM197組的相應處理(每組設3個復孔，重復3次)。細胞分組處理72 h后，吸去各孔培養(yǎng)液。加入500 μL Hoechst 33258染色液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置15 min。熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。

1.2.5 流式細胞術檢測 細胞分組處理72 h后，0.25%胰酶消化細胞，收集細胞1 000 r/min，離心半徑14 cm，離心5 min，棄上清。加入預冷的PBS重懸細胞，1 000 r/min，離心半徑14 cm，離心5 min，棄上清。加入1 mL預冷的75%乙醇，渦旋振蕩重懸細胞，4 ℃放置24 h，3 000 r/min，離心半徑14 cm，離心5 min，棄上清。加入預冷的PBS重懸細胞，3 000 r/min，離心半徑14 cm，離心5 min，棄上清。加入預冷的PBS重懸細胞，3 000 r/min，離心半徑14 cm，離心5 min，棄上清。加入PI染液500 μL(含PI 20 μg/mL)，重懸細胞，室溫避光2 h。調整細胞濃度為1×106/mL，上機檢測。實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達 PC-3細胞分組處理72 h后，0.25%胰酶消化細胞，1 000 r/min，離心半徑14 cm，離心5 min，棄上清，收集各組細胞。加入200 μL RIPA和4 μL PMSF混勻，冰上30 min。設置功率40 W、破碎2 s、間隔3 s、總時間20 s的工作模式，冰上超聲破碎細胞。4 ℃，13 000 r/min，離心半徑14 cm，離心20 min，收集上清，定量蛋白。Western blot檢測Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達，凝膠圖像分析系統(tǒng)Quantity One 4.5分析，保存實驗結果。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 CRM197蛋白在前列腺癌PC-3細胞中的表達

以抗CRM197多克隆抗體為一抗，Western blot驗證CRM197慢病毒作用PC-3細胞后能否正確表達CRM197蛋白。Western blot結果顯示，CRM197組PC-3細胞出現(xiàn)特異性條帶，而Con組、EV組細胞無特異性條帶的出現(xiàn)，這提示CRM197慢病毒作用前列腺癌PC-3細胞后能正確表達CRM197蛋白(圖1)。

2.2 CRM197慢病毒對細胞增殖的影響

將PC-3細胞接種于96孔板并分組處理細胞，MTT檢測并計算細胞增殖的抑制率。MTT結果顯示，CRM197組PC-3細胞的增殖抑制率為34.3%。與Con組和EV組相比，CRM197慢病毒明顯抑制PC-3細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而EV組和Con組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2、表1)。

圖2 CRM197慢病毒對PC-3細胞存活率的影響注：A：PC-3 細胞；B：空載體慢病毒作用后的PC-3細胞；C：CRM197慢病毒作用后的PC-3細胞

表1 CRM197慢病毒對PC-3細胞存活率的影響

注：與Con組相比，*P<0.05；與EV組相比，#P<0.05

2.3 CRM197處理細胞導致的凋亡形態(tài)學分析

將PC-3細胞接種6孔板，分組處理細胞后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。顯微鏡下觀察到，CRM197慢病毒作用72 h后，細胞變圓、皺縮、空泡、脫落、生長緩慢；而Con組細胞生長狀態(tài)良好，細胞增殖迅速(圖3)。

圖3 PC-3腫瘤細胞的形態(tài)變化注：A：PC-3 細胞；B：CRM197慢病毒作用后的PC-3細胞

2.4 CRM197處理細胞導致的細胞核形態(tài)改變

將PC-3細胞接種6孔板，分組處理細胞72 h后行Hoechst 33258染色，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。熒光顯微鏡下觀察到，CRM197組凋亡細胞比例明顯增加，細胞核出現(xiàn)核固縮、碎塊狀致密濃染或凋亡小體，而Con組和EV組凋亡細胞較少且細胞核沒有明顯變化。提示CRM197明顯促進細胞凋亡的進程(圖4)。

圖4 CRM197慢病毒對PC-3細胞核形態(tài)的影響 注：A、D：PC-3 細胞；B、E：空載體慢病毒作用后的PC-3細胞；C、F：CRM197慢病毒作用后的PC-3細胞

2.5 CRM197慢病毒對Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響

Western blot檢測Con組、EV組和CRM197組Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3凋亡相關蛋白的表達情況，比較各蛋白與β-actin的相對表達量。結果顯示，與Con組和EV組相比，CRM197組Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3的表達量都增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而EV組與Con組相比，Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示CRM197啟動線粒體凋亡途徑，從而誘導細胞凋亡(表2、圖5)。

組別Cleaved Caspase-9Cleaved Caspase-3Con組0.05±0.020.07±0.03EV組0.06±0.010.08±0.02CRM197組 0.17±0.03?# 0.28±0.04?#F28.50043.552P<0.001<0.001

注：與Con組比較，*P<0.05；與EV組比較，#P<0.05

圖5 CRM197慢病毒對Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響注：A：CRM197慢病毒作用后的PC-3細胞；B：PC-3 細胞；C：空載體慢病毒作用后的PC-3細胞

2.6 CRM197處理細胞導致的細胞凋亡率改變

將PC-3細胞接種6孔板分組處理細胞72 h后，通過PI染色檢測sub G1期細胞所占比例，定量凋亡的細胞數(shù)目。結果顯示，CRM197作用后PC-3細胞的凋亡率為13.7%，與Con組和EV組相比，CRM197明顯促進細胞凋亡，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。EV組與Con組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果提示，AdCRM197能夠誘導PC-3前列腺癌細胞發(fā)生凋亡(圖6、表3)。

圖6 CRM197慢病毒對PC-3細胞凋亡率的影響注：A：PC-3 細胞；B：空載體慢病毒作用后的PC-3細胞；C：CRM197慢病毒作用后的PC-3細胞

表3 CRM197慢病毒對PC-3細胞凋亡率的影響

注：與Con組比較，*P<0.05；與EV組比較，#P<0.05

3 討論

前列腺癌是歐美國家男性高發(fā)惡性腫瘤，目前在我國也呈現(xiàn)出逐年增長的趨勢[8]。由于我國群眾重視程度不高，常導致發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于前列腺癌晚期[6]。我國目前在前列腺癌治療方面多采用傳統(tǒng)的化療方法，但由于耐藥頻發(fā)，患者治療效果不佳，死亡率高[9-11]。面對重重障礙，尋找到一種新的治療方法迫在眉睫。

既往實驗[12-14]證實，CRM197蛋白干擾EGFR與HB-EGF結合，下調HB-EGF的表達，抑制細胞有絲分裂。CRM197蛋白還被用于治療口腔癌、黑色素瘤、急性T淋巴細胞性白血病等[15-17]，CRM197通過抑制細胞蛋白質的生成，抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲以及誘導腫瘤細胞凋亡，從而實現(xiàn)抗腫瘤作用。

CRM197重組慢病毒作用PC-3細胞后，Western blot檢測到CRM197的表達，這提示CRM197重組慢病毒在靶細胞中能正確表達CRM197蛋白。CRM197作用PC-3細胞后，細胞增殖的抑制率為34.3%。與Con組、EV組相比，CRM197明顯抑制PC-3細胞的增殖。Hoechst染色觀察到細胞核出現(xiàn)核固縮及凋亡小體。流式細胞檢測術顯示，CRM197作用后PC-3細胞的凋亡率為13.7%，與Con組和EV組相比，CRM197使sub G1期細胞增多，凋亡率升高。

Caspase-3、Caspase-9蛋白可促進細胞凋亡。Caspase-3通過裂解核小體間的DNA，引起細胞凋亡，且Caspase-3是各凋亡通路樞紐最重要的凋亡效應分子，Caspase-9作為Caspase-3最重要的激活劑，是調節(jié)細胞凋亡的關鍵分子[18]。為了探索CRM197誘導腫瘤細胞凋亡的機制，本研究對Caspase-3、Caspase-9凋亡相關蛋白的表達進行了檢測。Western blot顯示CRM197作用后，PC-3細胞中Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3表達呈上調狀態(tài)。結果提示，CRM197通過激活線粒體凋亡途徑而誘導腫瘤細胞凋亡。本研究顯示，CRM197重組慢病毒可通過抑制PC-3前列腺癌細胞的增殖，誘導PC-3細胞凋亡，增加Caspase-3和Caspase-9的表達，從而抑制前列腺癌的生長和增強化療藥物的敏感性。