轉錄因子SOX4在口腔扁平苔蘚癌變過程中的初步作用研究*

劉 奕，汪 頎，杜 芹，費 偉△

1.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 口腔科(成都 610072);2.電子科技大學附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院 口腔科(成都 610072);3.中國人民解放軍第四五二醫(yī)院 口腔科(成都 610000)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是人頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，占全身腫瘤的3%。每年全球有50萬新發(fā)病例，而其中僅50%的患者生存率>5年。由于OSCC的發(fā)生機制仍未明確，臨床仍很難把握其發(fā)生、發(fā)展和預后[1-2]?？谇槐馄教μ\(oral lichen planus,OLP)是一種T細胞介導的口腔黏膜非感染性慢性炎癥，世界衛(wèi)生組織(WHO)將OLP列為一種癌前病變，研究[3-4]表明，OLP患者罹患口腔鱗癌的風險概率比正常人群高約10倍，多在被診斷為OLP后的第6年左右發(fā)生癌變。SOX(SRY-related high-mobility-group box)基因是一類重要的轉錄調控因子，其功能涉及多種早期胚胎發(fā)育過程[5-6]。SOX4屬于SOX C亞族，表達于細胞核內，SOX4基因的突變、缺失或過表達可導致發(fā)育異?；蛳忍煨约膊?，也與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關。盡管SOX4在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，但SOX4是否在OLP癌變過程中發(fā)揮作用尚不清楚。因此，本實驗對轉錄因子SOX4在OLP和OSCC組織和細胞中的表達進行初步驗證，在后續(xù)實驗中將繼續(xù)利用RNA干擾技術研究SOX4在OLP癌變過程中對腫瘤細胞的增殖轉移是否發(fā)揮功能性作用。

1 材料與方法

1.1 病例收集

福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)標本為1997—2007年在美國加州大學洛杉磯分校(University of California,Los Angeles,UCLA)牙學院就診的30例患者的口腔黏膜組織標本，年齡35～85歲，其中10例為單純OLP患者標本，10例為來源于OLP的OSCC患者標本，以及10例OSCC患者標本(本實驗經(jīng)UCLA倫理委員會批準完成)。

1.2 免疫組織化學染色(immunochemistry，IHC)

石蠟切片按常規(guī)方法進行脫蠟，水合(二甲苯10 min,100% 乙醇3 min,95% 乙醇3 min,70% 乙醇3 min)?？乖迯屯瓿珊?，將切片置于0.3%過氧化氫-甲醇溶液中作用5 min以消除內源性過氧化物酶活性，10%(v/v)山羊血清封閉切片10 min，滴加一抗SOX4抗體(Abcam,Cambridge,MA,USA)(1∶100稀釋)4 ℃孵育過夜。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗抗兔IgG(1∶2 000稀釋，GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)，室溫孵育2 h。新鮮配制0.04%DAB顯色1～5 min，鏡下控制反應時間；蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。

1.3 蛋白提取和質譜分析

分別從OLP、OLP-OSCC、OSCC的FFPE石蠟塊中直接提取蛋白，步驟如下：FFPE標本制成10～15 μm的切片，置于Qproteome FFPE Tissue kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)試劑盒脫蠟過夜。在脫蠟水合完成后的沉淀物中加入試劑盒里的EXB緩沖液，按試劑盒推薦步驟提取蛋白。BCA法測量獲得蛋白的濃度。肽段的液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS/MS)分析使用NanoLC系統(tǒng)(Eksigent Technologies,Dublin,CA,USA)和LTQ 質譜儀(Thermo Fisher,Waltham,MA,USA)，步驟如下：胰蛋白酶(Promega,Madison,WI,USA)對所提取的SOX4蛋白進行溶液內酶解過夜，分離肽段，各餾分烘干，溶解在0.1%TFA中，C18 IntegraFrit色譜柱(New Objective,Woburn,MA,USA)對分離肽段進行濃縮除鹽10 min,C18反相毛細管柱(New Objective,Woburn,MA,USA)洗脫，溶解，備用。液相分離流動相的制備：A,5%乙腈/0.1%甲酸(v/v);B,95%乙腈/0.1%甲酸(v/v)。梯度分離流程：5%～15%流動相B中1 min,15%～100%流動相B中40 min,最后在置于100%流動相B中15 min。運行完成后由X-Tandem蛋白質質譜檢索軟件和Swissprot序列數(shù)據(jù)庫對肽和蛋白質進行鑒定，檢索參數(shù)設置：質量準確度0.4 Da，允許semi-style cleavage，酶為胰蛋白酶。特有肽段個數(shù)為2時視為鑒定成功的蛋白[7]。

1.4 細胞培養(yǎng)

正常人口腔角質形成細胞(normal human oral keratinocytes,NHOK)在EpiLife培養(yǎng)基+人角質形成細胞生長補充劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中培養(yǎng)，舌鱗狀細胞癌細胞系(UM1)在DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)+10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)+青霉素(100 U/mL)+鏈霉素(100 U/mL)中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，細胞90%～95%匯合后經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.5 SOX4 siRNA轉染UM1細胞

1.5.1 實驗分組 實驗組：轉染針對SOX4設計的特異性siRNA的UM1細胞(即：UM1/siRNA細胞)。對照組：轉染非特異性siRNA的UM1/siCTRL 細胞(陰性對照)；未處理的UM1(空白對照)。

1.5.2 實驗方法 參照LipofectamineTM3000試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)說明書指示：取對數(shù)生長期UM1細胞，調整細胞濃度為2×105個/mL，接種至六孔培養(yǎng)板過夜，培養(yǎng)。取雙鏈SOX4 siRNA(sc-38412)和非特異性對照siRNA(均來自Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA,USA)分別與稀釋后的轉染試劑混合，加入培養(yǎng)基孵育，過夜，更換新鮮的生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.6 蛋白免疫印跡分析(western blotting,WB)

WB檢測轉染前后SOX4在細胞中的蛋白含量。裂解NHOK和轉染前后的UM1細胞收集蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后按25 μg/孔上樣，經(jīng)4%～12% Bis-Tris NuPAGE膠條(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)進行SDS-PAGE電泳，Trans-blot SD半干轉膜儀(Bio-Rad,Brea,CA,USA)將蛋白轉移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉(Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,CA,USA)封閉1 h，一抗兔抗人SOX4抗體(Abcam,1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，其中β-actin為內參蛋白，TBST潤洗3遍，加入HRP標記的二抗抗兔IgG(GE Healthcare,1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST潤洗4遍，ECL試劑盒(GE Healthcare,Piscataway,NJ,USA)檢測蛋白印跡。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較采用t檢驗，檢驗水準α除特別說明外均設定為0.05。

2 結果

2.1 SOX4蛋白在OLP、OLP-OSCC和OSCC組織中的表達

IHC結果顯示了SOX4在FFPE樣本中的表達情況，陽性染色定位于細胞核，呈棕黃色或棕褐色。SOX4在OLP組織中幾乎不表達，在OLP-OSCC和OSCC組織中呈陽性表達(圖1)。

圖1 IHC法檢測SOX4在OLP、OLP-OSCC和OSCC組織中的表達注：A、B、C分別為OLP、OLP-OSCC和OSCC組的表達情況。各實驗組從上到下，放大倍數(shù)分別為×10、20、40倍

2.2 SOX4蛋白的篩選

LC-MS/MS結果顯示：分別從OLP、OLP-OSCC和OSCC的FFPE樣本中鑒定出了96、142和135種蛋白，其中，有54種蛋白在OLP和OLP-OSCC樣本中共同表達，有包含SOX4在內的88種蛋白只在OLP-OSCC樣本中表達。只在OLP-OSCC樣本中表達，且發(fā)揮促腫瘤作用的蛋白見表1。

表1 只在OLP-OSCC中表達的促腫瘤蛋白

2.3 SOX4在細胞中的蛋白表達水平

轉染前WB檢測結果顯示，SOX4蛋白在UM1細胞中的表達高于NHOK細胞，與IHC所示結果一致。以NHOK細胞中SOX4蛋白的相對表達量(設為1)為對照，在UM1細胞中為2.7，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2A)。UM1細胞被成功轉染siSOX4，WB檢測結果顯示，轉染后SOX4蛋白在UM1細胞中的表達低于對照組siCTRL在UM1中的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2B)。

圖2 WB檢測穩(wěn)定轉染siSOX4的UM1細胞中SOX4的表達

3 討論

在蛋白組學的研究中，蛋白組的質量對于鑒定及驗證工作至關重要。從存放時間10年的FFPE組織樣本中提取蛋白較困難，課題組在預實驗中首先使用同位素相對標記與絕對定量技術(iTRAQ技術)結合LC-MS/MS進行FFPE樣本的差異蛋白質組學的研究，然而在進行同位素標記多肽時未獲得成功，原因可能是由于FFPE樣本中的甲醛導致了分子間和分子內的交聯(lián)，阻礙了蛋白質的溶解。因此，課題組決定采用LC-MS/MS技術直接從FFPE樣本中抽提蛋白，分別從OLP、OLP-OSCC和OSCC的FFPE樣本中鑒定出了96、142和135種蛋白，然而未能獲取更多的蛋白，可能是由于甲醛導致的交聯(lián)改變了蛋白質和多肽的分子量，增加了蛋白質提取工作的難度。在我們鑒定出的88種只在OLP-OSCC中表達的蛋白中，有10種蛋白可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展(表1)，這些差異蛋白多為參與物質代謝及和生物轉化有關的酶類及結構蛋白，它們廣泛參與癌發(fā)生發(fā)展的病理過程，可能與OSCC發(fā)生密切相關。在這些差異蛋白中，SOX4被認為與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關，但其是否與OLP和OLP癌變相關未見報道。進一步研究這些促腫瘤蛋白對OSCC早期診斷具有潛在的臨床意義。

盡管WHO將OLP列為癌前病變，此舉仍然存在較大爭議。近年來的研究[8-10]表明，OLP的癌變率范圍為0%～12.5%，造成如此大的差異的一個重要原因是對OLP的臨床診斷標準不同或者病案追蹤時間不同。一項Meta分析發(fā)現(xiàn)，1988-2008年11 225例OLP患者中有183例患者(1.63%)發(fā)生了口腔癌，且大多在被診斷為OLP后的第6年左右發(fā)生癌變[4]。研究[3,11-12]認為，癌變可能與一系列源自炎性浸潤的分子刺激存在依賴性或相關性，OLP基底細胞受到強烈的淋巴細胞的攻擊發(fā)生突變，但上皮細胞幾乎不發(fā)生凋亡。在長期慢性的炎癥浸潤過程中，OLP基底細胞顯著增殖，這可能是OLP發(fā)生癌變的一個重要原因。

SOX基因是指具有一個HMG-box基序保守區(qū)，且編碼的蛋白質SRY/Sry(sex-determining region of Y chromosome)基因產物在該保守區(qū)具有60%以上氨基酸序列相似性的基因，可與DNA 序列特異結合，是一類重要的轉錄調控因子[5-6]。在乳腺癌的疾病進展中，SOX4作為上皮細胞間質轉型(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)的主要調節(jié)因子，可直接調控乳腺癌中的表觀遺傳修飾分子EZH2和致癌基因HER2/neu(c-ErbB2)的表達[13-14]。在OSCC中，不管原發(fā)灶的分化程度如何，SOX4在低分化OSCC以及鱗癌轉移灶中都呈過表達[15]。SOX4 siRNA能抑制LNCaP細胞中SOX4的過表達，誘發(fā)LNCaP前列腺細胞凋亡，且該效應能通過SOX4的過表達發(fā)生逆轉，推測SOX4可能成為前列腺癌的新治療靶點[16]。除此之外，研究[17-20]發(fā)現(xiàn)，SOX4在其他實體腫瘤中可發(fā)揮促癌作用。然而，也有研究[21]發(fā)現(xiàn)，SOX4可能是黑色素瘤的抑制基因，其表達在轉移性黑色素瘤中明顯降低，敲除SOX4基因后，黑色素瘤細胞遷移和侵襲能力增強。以往研究均表明，SOX4基因在多種腫瘤組織中呈異常表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關，但對SOX4基因在不同類型腫瘤中的具體作用機制研究未得到統(tǒng)一結論，作為轉錄因子，SOX4在基因表達復雜的調節(jié)網(wǎng)絡中，其功能也許不是單一的，腫瘤的類別、分級以及SOX4蛋白與其他調節(jié)蛋白的相互作用等因素共同決定著該基因在腫瘤中的確切作用[22]。

課題組在SOX4的表達驗證實驗中發(fā)現(xiàn)，相比OLP、SOX4蛋白在OLP-OSCC和OSCC樣本以及口腔鱗癌細胞UM1中表達升高，在SOX4基因敲減后，在UM1細胞中SOX4表達降低。此外，課題組正在進一步研究SOX4基因敲減后，UM1細胞體外和體內的生長變化，以及SOX4對炎癥相關腫瘤啟動子信號通路在OLP癌變過程中的影響機制研究，以期通過了解OLP癌變的具體機制，探索口腔黏膜慢性炎癥轉化為口腔鱗癌的內在機制。