安羅替尼對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲的影響*

宋永安，張雪燕，徐志偉，張曉菊

鄭州大學人民醫院 呼吸內科(鄭州 450000)

肺癌是常見的惡性腫瘤，病死率高，5年生存率<15%[1]。由于肺癌患病因素多、預后差，其治療難度較大。目前，最常見的肺癌類型是非小細胞肺癌(NSCLC)，約占所有肺癌的85%[2-3]。新發的非小細胞肺癌(NSCLC)患者中約40%為臨床Ⅳ期肺癌，姑息性化療的中位生存期僅為8～11個月，發生轉移的非小細胞肺癌通常被認為無法治愈[4]。因此，尋找更好的臨床療法來治療肺癌非常迫切。安羅替尼是我國正大天晴藥業集團自主研發的一種新型小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑[5]，能有效抑制VEGFR、PDGFR等激酶[6]，具有抗腫瘤血管生成和抑制腫瘤生長的作用，目前多種癌癥臨床試驗正在開展當中[7-8]。肺癌細胞的增殖、侵襲轉移是肺癌患者高病死率的主要原因，尋找更好的方法抑制肺癌細胞的增殖、侵襲轉移一直是肺癌治療研究的重點[9]。A549細胞系是體外最常見的非小細胞肺癌細胞系，本研究首次發現安羅替尼在體外能夠抑制肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲，有望為治療非小細胞肺癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人肺癌A549細胞購自中國科學院細胞庫(上海)；安羅替尼購自MCE有限公司(美國)；RPMI-1640培養基、胎牛血清購自BI公司(以色列)；CCK8試劑購自日本同仁有限公司(日本)；凋亡檢測試劑盒購自凱基生物有限公司(中國)；Transwell小室購自康寧公司(美國)；細胞培養皿和細胞培養板購自耐思生物科技公司(無錫)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將A549細胞用RPMI 1640完全培養基在培養箱中常規培養。完全培養基中含體積分數10%的胎牛血清。所有細胞約4 d傳代1次，隔1 d更換一次培養基，細胞處于對數期時用于實驗。

1.2.2 不同濃度安羅替尼對A549細胞增殖的影響 收集對數生長期的A549細胞，用培養基稀釋后均勻加至96孔板中，每孔細胞數為3 500個。24 h后，加入含不同濃度(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)安羅替尼的培養基作為實驗組，另外設置不加安羅替尼的陰性對照組。安羅替尼作用24、48或72 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃孵育4 h，然后用酶標儀450 nm波長處測定吸光度(n=3)。按照CCK8試劑盒說明書計算各組中A549細胞的生存率。

1.2.3 安羅替尼對A549細胞凋亡的影響 將消化下來的A549細胞以每孔5×105細胞接種于6孔板，過夜后加入含有不同濃度(0、4、8、16 μmol/L)安羅替尼的培養基再培養48 h。用不含EDTA的胰酶消化A549細胞，并用遇冷的PBS洗滌3次，收集細胞。在每組細胞中先加入5 μL Annexin V-FITC和500 μL緩沖液，混勻后再加入5 μL PI溶液。充分混勻后在室溫避光染色20 min。用流式細胞儀器收集1萬個細胞，根據試劑盒染色情況分析細胞凋亡情況(n=3)。

1.2.4 劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力 A549細胞以6×105個/孔接種于6孔板中，等到細胞長至約90%時，用無菌200 μL槍頭沿孔板中央劃一條直線，PBS清洗后，用含有不同濃度(0、1、2、4 μmol/L)安羅替尼的無血清培養基分組培養。分別在0、48 h用顯微鏡拍照，劃痕寬度用ImageJ軟件計算(n=3)。遷移率=1-48 h的劃痕寬度/0 h的劃痕寬度×100%。

1.2.5 Transwell細胞侵襲轉移實驗 先在24孔板各孔中加600 μL含20%血清的培養基，然后取出Transwell侵襲小室，放入24孔板各孔中，在Transwell小室內加入基質膠。等到基質膠凝固后將消化下來的A549細胞按每孔5×104個細胞接入Transwell小室，分組培養，小室中加入無血清培養基，使終體積為400 μL。Transwell小室和24孔板中均含有相同濃度的安羅替尼。在培養箱中培養48 h，棄去培養基。取出小室，用棉簽擦去小室內未穿過的細胞。24孔板中加4%多聚甲醛，并將Transwell小室浸入，室溫固定15 min，PBS清洗3次。移去小室，倒置風干。然后在24孔板中加入配置好的700 μL dipy溶液，將小室浸入其中，室溫避光染色15 min。取出小室，用PBS清洗3遍，并在顯微鏡下觀察(n=3)。每個小室取3個不同視野進行拍照，ImageJ軟件計數。實驗獨立重復3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 安羅替尼抑制A549細胞增殖

安羅替尼能抑制A549細胞的增殖(圖1)，A549細胞的抑制率隨著安羅替尼濃度的增加而增加，且安羅替尼作用時間越長，抑制作用越強，顯示出了時間依賴性。24 h的IC50值為43.82 μmol/L，48 h的IC50值為13.27 μmol/L，72 h的IC50值為6.47 μmol/L，顯示出了良好的細胞增殖抑制作用(表1)。

表1 安羅替尼對A549細胞增殖的影響

注：與0 μmol/L安羅替尼組比較，*P<0.05，與0 μmol/L安羅替尼組比較，**P<0.01

2.2 安羅替尼促進A549細胞凋亡

通過流式細胞術檢測安羅替尼對A549細胞凋亡的影響。發現處理48 h后A549細胞早期凋亡率和晚期凋亡率均有升高，其中晚期凋亡率比早期凋亡率升高的更顯著(表2、圖2)，說明安羅替尼可促進A549細胞凋亡來降低A549細胞的生存率。

表2 安羅替尼促進A549細胞凋亡

注：與0 μmol/L安羅替尼組相比，*P<0.05，與0 μmol/L安羅替尼組相比，**P<0.01

圖2 安羅替尼對A549細胞凋亡的影響

2.3 安羅替尼抑制A549細胞遷移

各組細胞在0 h和安羅替尼處理后48 h用顯微鏡拍照觀察細胞遷移情況。安羅替尼作用后A549細胞遷移能力降低，并且隨著安羅替尼濃度增加，細胞遷移率逐漸降低(圖3)，說明安羅替尼以濃度依賴的方式抑制A549細胞遷移。

圖3 安羅替尼抑制A549細胞遷移注：A：劃痕實驗遷移圖(光學顯微鏡，×10)；B：各組的遷移率。兩兩比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 安羅替尼抑制A549細胞侵襲

用Transwell實驗評價安羅替尼對A549細胞侵襲能力的影響，觀察到安羅替尼作用48 h后，穿過Transwell小室膜的細胞相對于對照組減少(圖4)，說明A549細胞的侵襲能力受到抑制且安羅替尼濃度越高，侵襲抑制作用越強。

圖4 不同濃度安羅替尼對A549細胞侵襲能力的影響注：A：Transwell圖(光學顯微鏡，×20)；B：各組中單個視野平均細胞數。兩兩比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

肺癌是危害人類健康的惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌病例的80%以上，目前整體5年生存率<15%[10]。肺癌的特征在于細胞不受控制的增殖，最常見的是上皮細胞(癌)[11]。患有晚期NSCLC的患者平均在診斷后18個月內死亡，轉移性傳播占死亡病例的70%以上[12]。肺癌細胞的增殖和轉移是肺癌患者高病死率的最主要原因，因此抑制肺癌細胞增殖、轉移是肺癌治療的重點。

A549細胞是體外實驗常用的非小細胞肺癌細胞系，本研究首次發現安羅替尼能抑制非小細胞肺癌系A549增殖、遷移和侵襲。腫瘤細胞的增殖往往與抵抗凋亡有關，腫瘤細胞可通過各種途徑逃避凋亡，使正常的凋亡通路失去功能，從而促進腫瘤細胞的發生和增殖[13]。本研究發現，安羅替尼對A549細胞增殖具有強烈的抑制作用，72 h的IC50值僅為6.47 μmol/L。本研究又用凋亡雙染法檢測了A549細胞的凋亡情況，發現安羅替尼濃度依賴性(4、8、16 μmol/L)地增加A549細胞凋亡比例，說明抑制A549細胞增殖作用與促進其凋亡有關。

楊斌等[14]發現安羅替尼能夠抑制肝癌細胞HCCC-9810的轉移與侵襲。平板劃痕實驗和Transwell實驗可評價細胞在體外的遷移、侵襲能力，平板劃痕實驗和Transwell實驗發現安羅替尼在低于IC50濃度時(1、2、4 μmol/L)便可以抑制A549細胞的遷移和侵襲，用4 μmol/L安羅替尼處理，A549細胞幾乎失去侵襲能力。

綜上所述，安羅替尼是我國自主研發的靶向藥，副作用小，該實驗首次發現了安羅替尼在體外對非小細胞肺癌A549增殖、遷移侵襲的抑制作用，有望為安羅替尼治療非小細胞肺癌提供新的理論基礎。