LC-MS/MS法同時測定大鼠組織中士的寧、馬錢子堿及其代謝物

李嘉華，蘇曉純，劉奕明，林愛華

(廣州中醫藥大學第二臨床醫學院1. 中藥藥代動力學實驗室、2. 珠海醫院藥劑科，廣東 廣州 510120)

士的寧(strychnine，STR)和馬錢子堿(brucine，BRU)作為中藥馬錢子的主要藥效生物堿成分，具有明顯的鎮痛[1-2]、抗炎[3-4]、抗腫瘤[5-7]、中樞神經系統興奮[8-9]等多種藥理活性。研究表明，其代謝產物士的寧氮氧化物(strychnine N-oxide，SNO)和馬錢子堿氮氧化物(brucine N-oxide，BNO)的毒性比原型物大大降低，且具有較好的生物活性。目前，關于4種成分的組織測定方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)，但存在分析時間長、靈敏度較低、專屬性和特異性不強等缺點[10-11]。本研究旨在建立快速、靈敏、準確的液相色譜-質譜聯用法(LC-MS/MS)，同時測定大鼠組織中STR、BRU、SNO和BNO的含量，比較正常和毒性劑量馬錢子總堿給藥后，4種成分的組織分布情況，為其在生物體內的代謝動力學研究提供測定方法，并為其毒性機制和藥理作用研究等提供更準確、可靠的科學依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑士的寧對照品(批號131030)、馬錢子堿對照品(批號131040)，成都普菲德生物技術有限公司；士的寧氮氧化物對照品(批號S450162)、馬錢子堿氮氧化物對照品(批號S450142)，Sigma-Aldrich公司；鹽酸麻黃堿對照品(批號0714-9402)，中國藥品生物制品檢定所，對照品純度均>98%。乙醇為分析純；甲酸、乙酸銨、甲醇，均為HPLC色譜純；水為Milli-Q超純水；馬錢子總堿由南京中醫藥大學藥劑實驗室饋贈，其中士的寧占33.33%，馬錢子堿占21.28%。

1.2 儀器SHIMADZU LC-20A高效液相色譜(日本島津公司)；API4000+型液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀(LC-MS/MS)，配備Turbo Ionspray離子源(ESI)及Analyst 1.6數據處理系統(美國AB Sciex公司)；Thermo SPD121P P1 真空離心濃縮儀(美國Thermo Fisher公司)；BF2000-30A氮氣吹干儀(北京八方世紀科技有限公司)；Microfuge 16臺式微量離心機(美國Beckman Coulter公司)。

1.3 實驗動物SPF級SD大鼠，♂，體質量(225±25)g，購于廣東省醫學實驗動物中心，合格證號：(粵)44007200008985。實驗前禁食12 h以上，自由飲水。

2 方法

2.1 色譜與質譜條件色譜條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)；流動相A為10 mmol·L-1乙酸銨(用甲酸調pH 4.0)，流動相B為甲醇，梯度洗脫：B相0～1 min，5%；1～6.5 min, 5%～70%；6.5～7.5 min，70%；7.5～7.6 min，70%～5%；7.6～11 min，5%，流速0.2 mL·min-1；柱溫30 ℃，進樣量5 μL。

質譜條件：電噴霧ESI離子源，檢測方式為正離子多離子反應檢測(MRM)；噴霧電壓為5500 V；霧化溫度為350 ℃。其他質譜參數設置分別為：碰撞氣(CAD)12 psi；霧化氣(GAS1)20 psi；簾氣(CUR)40 psi；用于定量分析的離子對分別為m/z 335.3→184.1(士的寧)，395.3→324.3(馬錢子堿), 351.4→334.1(士的寧氮氧化物)，411.2→394.2 (馬錢子堿氮氧化物)，166.2→148.3(內標鹽酸麻黃堿)。

2.2 溶液的制備分別精密稱取STR、BRU、SNO和BNO 1.05 mg、1.17 mg、1.06 mg和1.17 mg，甲醇溶解，配成濃度分別為105、117、106、117 mg·L-1的儲備液。精密稱取鹽酸麻黃堿(IS)1.39 mg，甲醇溶解，得到終濃度為139 μg·L-1的內標工作液。精密稱取適量馬錢子總堿，PBS ∶乙醇=80 ∶20溶解，配成濃度0.3 g·L-1的溶液。以上溶液均于4 ℃冷藏備用。

2.3 組織勻漿樣本處理各組織樣品稱重，以質量體積比1 ∶3的比例加入超純水，勻漿。精密移取內標工作液(139 μg·L-1)20 μL，常溫真空濃縮后加入組織勻漿200 μL，震蕩渦旋30 s混勻，加入40 μL氨水堿化，渦旋30 s，加入4 mL氯仿，充分渦旋2 min，3 750 r·min-1離心10 min，取下層有機相于35 ℃下N2吹干，使用200 μL流動相[甲醇 ∶10 mmol·L-1乙酸銨(用甲酸調pH 4.0)=40 ∶60]復溶，渦旋2 min，14 000 r·min-1離心15 min，過濾，取上清液進行分析，進樣量5 μL。

2.4 給藥與組織樣品采集SD大鼠隨機分為正常和毒性劑量組，每組25只。每組大鼠按時間點隨機分成5組，每個時間點5只。正常和毒性劑量組分別灌胃馬錢子總堿溶液1.2 mg·kg-1(STR 0.4 mg·kg-1，BRU 0.2554 mg·kg-1) 和3.0 mg·kg-1(STR 1 mg·kg-1，BRU 0.6385 mg·kg-1)，分別于給藥后5、15、30、60、120 min麻醉，分離心、肝、脾、肺、腎和腦，臟器用超純水洗凈，濾紙吸干，于-80 ℃保存。

3 結果

3.1 專屬性分別取來自6只大鼠的空白腎組織勻漿(以腎組織為代表)，空白腎組織勻漿加4種待測物和內標，以及大鼠灌胃給藥后的腎組織勻漿樣品，按照“2.3”項下操作，在選定的檢測條件下考察5種分析成分。Fig 1結果顯示，STR、BRU、SNO、BNO和內標的保留時間分別為8.31、8.33、8.86、8.82、7.56 min，組織中內源性物質不會對待測成分產生干擾，峰形良好。

3.2 標準曲線與定量下限分別精密吸取適量STR、BRU、SNO和BNO儲備液，用甲醇逐級稀釋成系列標樣，精密吸取200 μL標樣，真空濃縮，分別加入到200 μL空白大鼠組織勻漿中，按“2.3”項下操作，分別以STR、BRU、SNO和BNO與內標鹽酸麻黃堿的峰面積比值對各自相應的濃度進行加權(1/X2)線性回歸。定量下限(LLOQ)為標準曲線的最低濃度。所得回歸方程及定量下限見Tab 1，各成分在測定范圍內線性關系良好。

3.3 精密度與準確度分別配制低、中、高濃度的質控樣品：STR 3.00、30.03、390.39 μg·L-1，BRU 3.01、30.10、390.90 μg·L-1，SNO 0.901、9.01、117.13 μg·L-1，BNO 0.901、9.01、117.12 μg·L-1，按“2.3”項下操作，每個質量濃度平行5份，連續測定3 d，以當天隨行的標準曲線測定質控樣品濃度。結果顯示，心、肝、脾、肺、腎、腦組織中的相對回收率和日內、日間精密度分別為STR：(87.66±1.01)%～(112.51±3.40)%、2.13%～9.31%、1.29%～14.70%；BRU：(87.16±1.07)%～(110.49±1.74)%、2.83%～9.36%、1.34%～14.13%；SNO：(86.84±1.71)%～(113.77±5.19)%、2.14%～10.02%、0.34%～14.90%；BNO：(85.94±1.43)%～(113.29±5.46)%、2.05%～9.31%、0.90%～14.30%。均符合生物樣品分析的方法學要求。

3.4 提取回收率及基質效應按“3.3”項下操作，配制低、中、高3個濃度水平的STR、BRU、SNO、BNO組織質控樣品(以腎組織為代表)，每個濃度平行操作5份，按“2.3”所述操作，進樣考察，峰面積記作A1；取空白組織勻漿同樣操作，N2吹干后殘渣分別加入相應低、中、高濃度的對照品溶液復溶，進樣考察，峰面積記作A2，以A1/A2×100%為提取回收率(Tab 2)。分別配制含有低、中、高濃度STR、BRU、SNO、BNO的混合標準品溶液，直接進樣，峰面積記作A3，以A2/A3×100%為基質效應，見Tab 2。

3.5 穩定性按“3.3”項下操作，配制低、中、高3個濃度STR、BRU、SNO、BNO的質控樣品(以腎組織為代表)，每個濃度5個樣本，分別考察樣品在室溫放置4 h，反復凍融3次，以及制備好的待測液4 ℃放置12 h條件下的穩定性。Tab 3結果表明，4種成分在上述條件下均較為穩定。

3.6 組織分布大鼠單次灌胃馬錢子總堿溶液正常和中毒劑量后，正常劑量組STR在各組織中含量排列順序為：腎>脾>肝>肺>心>腦(Fig 2A)，毒性劑量組的順序依次為：腎>肝>肺>脾>心>腦(Fig 2B)；正常劑量組BRU含量依次為(Fig 3A)：腎>肝>脾>肺>心>腦，毒性劑量組的含量依次為：肝>腎>脾>肺>心>腦(Fig 3B)；正常劑量和毒性劑量組SNO含量依次為：脾>肝>腎>肺(Fig 4)。代謝產物BNO濃度低于定量限。

Fig 1 Representative MRM chromatograms

A: Blank kidney homogenate; B: Blank kidney homogenate spiked with analytes and IS; C: Kidney homogenate obtained from a rat after intragastric administration of Semen Strychni total alkaloids.

Tab 1 Standard curves and lower limit of quantification of strychnine, brucine, strychnine N-oxide and brucine N-oxide in samples

Tab 2 Recovery and matrix effect of strychnine, brucine, strychnine N-oxide and brucine N-oxide in kidney QC

Tab 3 Stability data of strychnine, brucine, strychnine N-oxide and brucine N-oxide in kidney QC

Fig 2 Tissue distribution of strychnine in rats following single intragastric administration of total alkaloids from Semen

A:Normal dose; B: Toxic dose.

4 討論

本文建立了LC-MS/MS同時測定大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦組織中馬錢子堿、士的寧及其氮氧化物含量的分析方法，以10 mmol·L-1乙酸銨(用甲酸調pH=4.0)-甲醇為流動相進行梯度洗脫，內源性雜質干擾小，峰形對稱，分離度好；采用正離子多離子反應檢測，質譜響應及靈敏度高。在樣品前處理條件優化過程中，比較了不同處理方法(甲醇沉淀法、氯仿液液萃取法)，并進一步考察了氯仿多步和一步液液萃取，及氯仿體積(3、4 mL)對4種待測物提取回收率的影響。另外，由于馬錢子堿和士的寧均為堿性藥物成分，因此，采用氨水堿化生物樣品[12]，提高提取效率。

Fig 3 Tissue distribution of brucine in rats following single intragastric administration of total alkaloids from Semen

A: Normal dose; B: Toxic dose.

Fig 4 Tissue distribution of strychnine N-oxide in rats following single intragastric administration of total alkaloids from Semen

A: Normal dose; B: Toxic dose.

組織分布結果顯示，正常和毒性馬錢子總堿劑量下，STR和BRU在大鼠主要臟器中分布相似，其中以肝臟和腎臟最高，脾臟濃度也較高，腦中的分布量最少。提示STR和BRU可能存在肝臟的代謝或膽汁排泄；腎臟很可能是其主要的排泄途徑；脾臟濃度較高，推測這與其具有免疫調節的作用可能有關；STR和BRU均能透過血腦屏障，但透過能力有限。

兩種劑量給藥后，SNO在主要臟器中均能檢出(腦、心除外)，但是濃度較低，遠低于STR原型物，說明在體內STR確實可轉化成SNO，但STR可能不是以SNO的形式在體內蓄積。BRU在體內可代謝成BNO[13-14]，本實驗僅在毒性劑量給藥后的個別肝臟樣品中測到，但測得的BNO濃度低于定量下限。

綜上所述，本研究建立了靈敏、快速和準確的LC-MS/MS法測定STR、BRU、SNO和BNO，基于該法比較了正常和毒性劑量馬錢子總堿給藥后，4種成分在大鼠組織中的分布特征，為其在生物體內的代謝動力學研究奠定了基礎，并對闡明其藥理毒理機制有重要意義。