A型流感病毒對肺巨噬細胞自噬的影響及麻杏石甘湯含藥血清的干預作用

李 玲，張 波，盧芳國，蔡 亮，高 強，胡 玨，何谷良，吳 濤

(湖南中醫藥大學1. 中醫學院、2. 醫學院，湖南 長沙 410208；3. 湖南省疾病預防控制中心微生物檢驗科，湖南 長沙 410000；4. 湖南中醫藥大學研究生學院，湖南 長沙 410208)

流感性感冒(簡稱流感)是目前尚未得到有效控制的全球性急性呼吸道傳染病，而A型流感病毒是人和動物流感的主要病原體[1-2]。近年研究發現，當流感病毒入侵時會誘導宿主細胞產生自噬，進而加劇流感病毒的致病作用，因此，具有調節細胞自噬功能的藥物可能是流感治療的有效靶點[3-4]。中醫藥防治流感歷史悠久，優勢明顯。源自東漢醫圣張仲景《傷寒論》的麻杏石甘湯是治療外感發熱肺熱證的常用方，更是近年廣泛用于治療證屬熱毒襲肺證和熱毒壅肺證流感的基本方[5]。

本課題組前期研究結果表明，麻杏石甘湯(Maxing Shigan decoction，MXSGD)能通過調節細胞因子的分泌等方式，發揮抗流感病毒作用，是較為理想的研究對象[6-8]。本研究將結合前沿的基礎研究成果和已開展的前期研究工作，從形態-功能-分子三方面，探討麻杏石甘湯是否通過調控流感病毒誘導的肺巨噬細胞自噬，最終實現干預流感病毒的致病作用及其效應機制，部分揭示麻杏石甘湯抗流感病毒的新作用靶點，豐富中醫藥防治流感病毒感染的科學內涵。

1 材料

1.1 藥物與試劑麻杏石甘湯(麻黃9 g、杏仁9 g、石膏18 g、炙甘草6 g)購自湖南中醫藥大學附屬第一醫院門診藥房；磷酸奧司他韋膠囊(瑞士羅氏，批號B3017，每粒75 mg)；胎牛血清(Gibco)；自噬抑制劑3-MA(Selleck，S2767)；雷帕霉素(rapamycin，RAPA)(Sigma，553210)；麻黃堿對照品(批號：C15894)、偽麻黃堿對照品(批號：JA187615)、苦杏仁苷對照品(批號：B20687)、甘草酸銨鹽對照品(批號：B20418)，均購自上海源葉生物；甲醇、乙腈(色譜純，美國TEDIA)； LC3抗體(CST，4108)；β-actin抗體(Abcam，ab8227)；FTIC標記的羊抗兔二抗(Proteintech，SA00003-2)；RIPA蛋白裂解液(CWBIO，CW2334S)；ECL發光檢測試劑盒(Thermo Fisher，35055)。

1.2 儀器3111 CO2細胞培養箱、1300生物安全柜(美國Thermo Scientific)；AE31倒置顯微鏡(廈門Motic)；CytExpert流式細胞儀(美國Beckman Coulter)；Tecnai G2 spirit透射電子顯微鏡(美國FEI)；A1R+激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon)；1525高效液相色譜儀(美國Waters)；Synergy2多功能酶標儀(美國Bio-Tek)。

1.3 細胞株小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7，購于中國科學院細胞庫，由本室傳代培養后使用。

1.4 流感病毒株A型流感病毒(influenza A virus，IAV)，A/PR/8/34株，由湖南師范大學病毒研究室惠贈。經10日齡雞胚尿囊腔接種培養傳代，血凝效價實驗測定效價在1 ∶640以上者供實驗用(本實驗感染復數，MOI=0.1)。置于冰袋中備用。

1.5 實驗動物成年健康新西蘭大白兔12只，♂，體質量(1.8±0.2)kg，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(湘)2015-0004。適應性飼養1周。

2 方法

2.1 制備含藥血清按動物體表面積劑量換算法，根據《方劑學》和《中藥藥理學》煎煮制備4倍臨床等效劑量的麻杏石甘湯水煎液[9]。同時用雙蒸餾水配制4倍臨床等效劑量的陽性藥物奧司他韋水溶液。分別灌胃新西蘭大白兔各6只，1次/日，連續7 d，末次給藥2 h后，兔心臟采血，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，得到空白血清、麻杏石甘湯含藥血清和奧司他韋含藥血清，同組兔血清混合并56 ℃ 滅活，過濾除菌，-20 ℃保存備用。用HPLC檢測麻杏石甘湯和奧司他韋含藥血清主要成分含量穩定，可用于后續實驗。

2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測各組細胞的自噬情況常規培養RAW264.7細胞，以3×103個/孔接種于12孔培養板，培養16 h,待細胞貼壁后，棄原培養液，加入無血清培養基培養24 h，使細胞同步化到G0期后備用。實驗分組方式見Tab 1。加入上述相應的干預因素，干預12 h后，處理細胞。進行如下操作：4%多聚甲醛固定30 min，冷0.01 mol·L-1PBS洗5 min×2次，5% BSA封閉30 min后，每孔加入一抗兔源LC3Ⅱ(1 ∶200)50 μL，4 ℃孵育過夜；室溫孵育1 h，棄液，洗5 min×3次；加入FITC標記抗兔IgG(1 ∶200)，37 ℃避光孵育30 min，棄液，洗5 min×5次；抗熒光淬滅劑的封片劑封片。共聚焦顯微鏡下檢測。

2.3 透射電鏡技術檢測各組細胞的自噬情況和病毒顆粒分布情況常規培養RAW264.7細胞，以5×103個/孔接種于6孔板，實驗分組方式同前。加入上述相應的干預因素，干預12 h后棄液，洗2次。消化重懸細胞并收集于EP管中。進行如下操作：1 000 r·min-1離心5 min，去上清，可見細胞沉淀，再慢慢滴入0.25%戊二醛，室溫放置1 h后，4 ℃保存；1%鋨酸后固定2 h，依次以50%、70%、90%、100%的丙酮脫水，包埋、染色；透射電子顯微鏡觀察單位面積細胞內自噬體數目和形態。

Tab 1 Grouping and intervention

2.4 Western blot法檢測各組細胞自噬標志蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達細胞培養及干預方式同前，進行如下操作：吸去上清，PBS洗滌，刮下細胞，1 000 r·min-1離心5 min后，棄上清，加入100 μL RIPA裂解液(含1 mmol·L-1PMSF)，冰上充分混勻后靜置20 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清測定總蛋白濃度。取50 μg總蛋白上樣， SDS-PAGE電泳，濕法轉膜后封閉1 h，加入LC3和β-actin抗體(1 ∶1 000)，孵育過夜，二抗(1 ∶3 000)室溫孵育1 h，暗室加ECL化學發光劑，于化學發光儀成像，用圖像分析軟件Image Lab5.0對圖像進行信號分析，并計算靶蛋白/內參蛋白的比值。

3 結果

3.1 麻杏石甘湯含藥血清對流感病毒誘導的細胞自噬的影響如Fig 1所示，激光共聚焦顯微鏡下可見細胞內有綠色熒光(LC3)分布，用IPP6.0軟件對細胞內綠色熒光聚集體的數量和強度進行IOD分析，結果顯示流感病毒能有效誘導巨噬細胞的自噬，與已被證明可以誘導自噬的陽性藥物RAPA組接近，與空白組和自噬抑制劑3-MA組比較，差異有顯著性(P<0.01)，且3-MA能有效抑制流感病毒誘導的細胞自噬。而各含藥血清亦能不同程度抑制流感病毒誘導的細胞自噬，其中麻杏石甘湯含藥血清濃度與LC3表達量(IOD值)呈負相關，相關系數r=-0.784，P=0.012。

3.2 麻杏石甘湯含藥血清對流感病毒誘導的細胞自噬和病毒顆粒分布的影響如Fig 2所示，透射電鏡下可觀察自噬體的形成：吞噬泡(phagophore)-自噬小體(autophagosome)-自噬溶酶體(autolysosome)。結果顯示，流感病毒能有效誘導巨噬細胞的自噬，不同階段的自噬體明顯增多，與已被證明可以誘導自噬的陽性藥物RAPA組接近，與空白組和自噬抑制劑3-MA組比較，差異有顯著性(P<0.01)，且3-MA能有效抑制流感病毒誘導的細胞自噬。而各含藥血清亦能不同程度抑制流感病毒誘導的細胞自噬，其中麻杏石甘湯含藥血清濃度與自噬泡數量呈負相關，相關系數r=-0.884，P=0.002。

3.3 麻杏石甘湯含藥血清對流感病毒誘導的細胞自噬標志蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達的影響如Fig 3所示，流感病毒能有效誘導巨噬細胞的自噬，自噬標志蛋白LC3Ⅱ含量明顯升高，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，與RAPA組接近，與空白組和自噬抑制劑3-MA組比較，差異有顯著性，且3-MA能有效抑制流感病毒誘導的細胞自噬。而各含藥血清亦能不同程度抑制流感病毒誘導的細胞自噬標志蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，其中麻杏石甘湯含藥血清濃度與LC3表達量(相對蛋白表達量)呈負相關，相關系數r=-0.962，P=0.000。

Fig1LC3expressionincellsofeachgroup(× 600) A:Control; B: RAPA; C: 3-MA; D: IAV; E: Positive control; F: Oseltamivir; G: L-MXSGD; H: M-MXSGD; I: H-MXSGD.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsIAV.

Fig2Ultrastructuralobservationofcellsineachgroup(×2 000)

A: Control; B: RAPA; C: 3-MA; D: IAV; E: Positive control; F: Oseltamivir; G: L-MXSGD; H: M-MXSGD; I: H-MXSGD.

Fig 3 Protein expression of LC3-Ⅰ and LC3Ⅱ

A: Control; B: RAPA; C: 3-MA; D: IAV; E: Positive control; F: Oseltamivir; G: L-MXSGD; H: M-MXSGD; I: H-MXSGD.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsIAV.

4 討論

自噬是潛在的流感病毒與宿主之間相互作用的一個重要機制，因此，近些年研究者開始關注流感病毒感染和自噬機制之間的復雜關系。越來越多的證據表明，流感病毒可以引起自噬，是流感病毒的復制的一個必要過程[10-14]。因此，細胞自噬在流感病毒感染誘導炎癥損傷中的作用機制是研究藥物防治流感病毒感染引起炎癥反應的重要靶點之一。

麻杏石甘湯方中君藥辛溫宣肺之麻黃與辛甘大寒清肺熱之生石膏，兩藥合用相反相成，相制為用；臣藥苦降利肺氣之杏仁味，助君藥清肺熱定平喘；佐藥炙甘草益氣和中，調和諸藥。四藥合用，共成辛涼疏表，清肺平喘之功效。同時，在中醫理論指導下，根據其配伍原則，該方前期研究顯示，其能通過多途徑、多靶點防治流感病毒感染引起的肺部炎癥[6-8]。

本研究結果顯示，不同濃度的麻杏石甘湯含藥血清能有效抑制流感病毒誘導的細胞自噬，表現在下調LC3Ⅱ的表達，糾正LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的平衡，減少自噬體的形成，且呈現一定的量效關系。為本課題組研究麻杏石甘湯防治流感病毒感染，找到了新的作用靶點，隨著現代醫學研究技術的發展和研究的不斷深入，本課題組的后續研究將以此為基礎進行進一步的機制探討，以期找到麻杏石甘湯抑制流感病毒誘導的細胞自噬的作用機制，以及關鍵的效應物質。

綜上所述，麻杏石甘湯可能通過抑制流感病毒誘導的細胞自噬，最終調控流感病毒的致病作用，但其進一步的作用機制還需深入研究。