青蒿琥酯抗小鼠血吸蟲性肝纖維化的作用

孔慶明，戴方偉，丁豪杰，鄭清四，盧領群，卓洵輝，樓 琦，樓 滌，鄭 斌，丁建祖，褚曉峰，陸紹紅

(1. 浙江省醫學科學院寄生蟲病研究所，2. 浙江省實驗動物中心，浙江 杭州 310013；3. 桂林南藥股份有限公司，廣西 桂林 541004；4. 浙江省實驗動物公共服務平臺，浙江 杭州 310013)

肝纖維化是肝臟對病毒、寄生蟲感染、酒精濫用、代謝性疾病等各種病因所引起的慢性損傷的一種反應，是各種慢性肝病共同的病理學基礎，也是肝硬化形成的必經階段[1]。血吸蟲病是一種流行廣泛、嚴重危害人類健康和社會經濟發展的人獸共患寄生蟲病。血吸蟲尾蚴感染宿主后，雌性成蟲所產蟲卵大部分沉積于肝、腸等組織中，在與機體相互作用的過程中形成蟲卵肉芽腫、組織損傷和繼發性肝纖維化。肝纖維化是導致血吸蟲病患者門脈高壓、腹水、上消化道出血等嚴重并發癥與死亡的最根本原因[2]。肝纖維化是一個可逆的病理過程，去除致病因素可以明顯減輕肝纖維化，使肝臟功能恢復正常。如果不加以治療，肝纖維化會轉變為肝硬化[3]。對浙江嘉興市吡喹酮救治的晚期血吸蟲病患者隨訪發現，血吸蟲病肝纖維化指標異常者仍然高達75.4%，徹底殺蟲治療并不能中止血吸蟲病肝纖維化的進展[4-5]。雖然抗肝纖維化藥物相關研究取得了一些進展，但是目前臨床尚無理想的抗肝纖維化特效藥物。

青蒿琥酯(artesunate，ART)是一種高效抗瘧藥，也是有效的血吸蟲病預防藥物。國內研究表明，ART能抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)增殖，具有抗四氯化碳致大鼠肝纖維化以及大鼠免疫性肝纖維化作用[6-8]。殼多糖酶在上皮細胞功能失調、免疫細胞活化、炎癥反應與纖維化生成中起重要作用[9]。另外，ART可抑制p-ERK1/2的表達[10]，提示ART抗肝纖維化的作用可能與抑制ERK通路有關。本研究擬以血吸蟲性肝纖維化小鼠為動物模型，隨機分為ART高、低劑量治療組、模型組和正常組，以肝組織病理形態觀察，結合透明質酸(hyaluronic acid， HA)、基質金屬蛋白酶抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)和Ⅲ型膠原α1(collagen type Ⅲ alpha 1，Col3α1)等分子指標，綜合評估治療前后的肝纖維化進程；通過肝組織中殼多糖酶3樣蛋白1(chitinase-3-like protein 1，CHI3L1)、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)等的表達調控，探討ART通過CHI3L1/ERK通路，改善血吸蟲性肝纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6周齡ICR清潔級♀小鼠，購自浙江省醫學科學院實驗動物中心。生產許可證號：SCXK(浙)2014-0001，使用許可證號：SYXK(浙)2014-0008。日本血吸蟲感染釘螺，購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.2 藥物、試劑與儀器青蒿琥酯粉劑(批號：170204)，由桂林南藥股份有限公司惠贈；吡喹酮(批號：170306)，上海新華聯制藥有限公司生產，使用0.04 mol·L-1的羧甲基纖維素鈉配制成混懸液備用。HE染色試劑盒(批號：G1120)、Masson染色試劑盒(批號：G1345)，購自上海索萊寶生物科技有限公司；PCR引物，由上海生工生物工程公司合成；TGF-β1抗體(Abcam公司，貨號ab92486)；抗ERK(貨號4695)、p-ERK抗體(貨號4370)，均購自CST公司；CHI3L1抗體(上海生工，貨號D120410)；β-actin抗體(Servicebio，貨號GB12001)。ADVIO 2400全自動血清生化分析儀(拜耳中國有限公司)；CFX96TM熒光定量PCR儀(伯樂生命醫學產品上海有限公司)。

1.3 肝纖維化小鼠模型的建立與實驗分組小鼠經腹部剃毛貼片感染日本血吸蟲尾蚴，建立動物模型，每只感染(20±2)條尾蚴。24只清潔級小鼠隨機分為4組，包括正常組、模型組、ART高、低劑量治療組(50、25 mg·kg-1·d-1)。各組在感染血吸蟲尾蚴7周后，進行連續3 d的吡喹酮灌胃殺蟲，劑量為180 mg·kg-1·d-1。根據《日本血吸蟲病肝纖維化診斷與療效評估方案》說明，抗纖維化藥物治療在感染后16周開始，每天灌胃給藥，連續8周，停藥后4周處死小鼠，取肝臟備用。

1.4 血清肝纖維化指標檢測采用全自動血清生化分析儀檢測血清HA、Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ，CIV)和血清層黏連蛋白(laminin，LN)。

1.5 肝臟組織病理學觀察肝組織經福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，常規組織切片，進行HE染色和Masson染色觀察。根據《日本血吸蟲病肝纖維化診斷與療效評估方案》的規定，結合《肝纖維化診斷及療效評估共識》，對肝臟的炎癥與纖維化程度進行半定量計分。

1.6 肝纖維化與CHI3L1/ERK通路相關基因的qPCR與Western blot檢測無菌刀片于干冰上，將組織樣品切割成約3 mm×3 mm×3 mm大小，置于裝有1 mL TRIzol裂解液的1.5 mL EP管中。將超細勻漿機工作頭浸入TRIzol裂解液中5～10 s滅活RNA酶后，組織研磨。參照TRIzol試劑盒步驟抽提RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。采用SYBR Green實時熒光定量PCR兩步法檢測小鼠肝組織內纖維化與ERK信號通路相關基因：平滑肌肌動蛋白α2(alpha-actin-2，ACTA2)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、TGF-β1、CHI3L1、Col3α1、TIMP-1、ERK1/2(MAPK1、MAPK3)的mRNA表達水平，以GAPDH為內參基因，2-ΔΔCt相對定量法處理數據。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers for qPCR

取各組肝組織提取總蛋白，Bradford法測定蛋白含量。總蛋白變性5 min后進行Western blot實驗。TGF-β1、ERK、p-ERK、CHI3L1抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1 ∶3 000)，以β-actin為內參。

2 結果

2.1 ART對小鼠血清肝纖維化指標的影響Tab 2結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清HA水平明顯升高(P<0.01)，含量大于1 mg·L-1。與模型組(HA以1 mg·L-1計算)比較，ART組小鼠血清HA水平呈降低趨勢，高劑量組小鼠血清HA水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，各組小鼠血清CIV和LN水平無明顯變化。

GroupHACⅣLNControl171.43±21.25??99.90±47.2681.89±8.38Model>1000.0068.01±14.5653.03±13.93ART-25751.40±217.0064.97±16.1277.55±12.34ART-50264.80±57.62??91.04±51.6565.50±5.39

**P<0.01vsmodel

2.2 肝、脾形態與肝組織病理學指標分析正常組小鼠的肝脾顏色、體積、質地正常。模型組小鼠肝脾臟器顏色深紫，質地粗糙，脾臟體積明顯增大。ART組小鼠肝脾形態有所改善(Fig 1A)，尤其高劑量給藥組。Tab 3結果顯示，正常組小鼠脾質量指數與模型組比較明顯減小，差異具有顯著性(P<0.01)。ART高劑量組小鼠的脾臟質量指數與模型組比較明顯減小，差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 1B的HE染色結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織正常結構被破壞，肝細胞索排列紊亂，可見界板及中央靜脈周圍肝細胞壞死及較多炎癥細胞浸潤；匯管區結締組織不同程度增生擴大，向小葉內延伸，將肝小葉分隔成大小不等的肝細胞團。ART組的病理損害均減輕。Fig 1C的Masson染色顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織膠原增生明顯，并與鄰近匯管區及肝靜脈相連，纖維間隔較厚。ART組匯管區及小葉內、小葉間膠原纖維間隔減少、變細。各組小鼠肝纖維化、炎癥分期見Tab 3，ART高劑量組肝纖維化評分較正常組下降超過2分，說明ART治療血吸蟲性小鼠肝纖維化有效。

Tab 3 Effects of artesunate against liver fibrosis

**P<0.01vsmodel

2.3 ART對血吸蟲性肝纖維化小鼠肝組織CHI3L1/ERK信號通路的影響qPCR檢測結果顯示(Fig 2A)：與正常組比較，模型組小鼠肝纖維化評估指標TIMP-1、Col3α1 mRNA表達明顯增加(P<0.01)，ERK通路相關分子ACTA2、CTGF、TGF-β1、ERK1/2(MAPK1、MAPK3)的mRNA表達量也升高，其中，CHI3L1和ERK1/2基因的表達量升高差異具有顯著性(P<0.01)。Western blot結果也顯示(Fig 2B)，與正常組比較，模型組中CHI3L1、TGF-β1蛋白的表達以及ERK1/2蛋白的磷酸化水平明顯升高，血吸蟲肝纖維化發生過程中，ERK通路被激活。給予ART干預后，與模型組相比，ART組小鼠肝臟TIMP1、Col3α1 mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)，

Fig 1 Hepatic pathology changes of artesunate against liver fibrosis in Schistosoma japonicum infection

Fig 2 Effects of artesunate on expression of CHI3L1/ERK pathway in liver fibrosis induced by Schistosoma japonicum

A: Real-time PCR; B: Western blot.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

ART高劑量組小鼠肝臟ERK通路相關分子ACTA2、CTGF、TGF-β1、CHI3L1和ERK1/2表達量降低，其中CHI3L1和ERK1/2基因的表達量的降低具有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，ART組中CHI3L1、TGF-β1蛋白的表達水平以及ERK1/2蛋白的磷酸化水平明顯降低，說明ERK信號通路被抑制，ART能夠通過CHI3L1/ERK信號通路介導抗血吸蟲性肝纖維化。

3 討論

理想的動物模型在肝纖維化病理和藥效評價等方面具有重要的意義。病毒、酒精、飲食和血吸蟲是導致人類肝纖維化的主要病因，前幾種病因至今尚無理想的動物模型，尤其無法復制與臨床情況相似的肝纖維化動物模型。大鼠是日本血吸蟲的半適宜宿主，大鼠體內的蟲體不能或較難發育為成蟲，所以在肝臟較難觀察到蟲卵引起的病變[11]。兔子是日本血吸蟲的適宜性宿主，但是日本血吸蟲感染兔的晚期肝纖維化緩慢可逆[12]。小鼠感染血吸蟲后，其肝臟在蟲卵肉芽腫機械性、炎性因子和細胞因子等綜合因素作用下，能夠形成與血吸蟲病患者肝纖維化相似的發病進程，是目前研究日本血吸蟲病肝纖維化發病機制及藥物防治較為理想的實驗動物模型[13]。本研究以日本血吸蟲感染方式構建了小鼠肝纖維化模型，該模型具有一次處理即可成模、纖維化病變與臨床相似、模型可標準化、經濟等特點，適用于肝纖維化發生機制的研究。研究中，模型組血清肝纖維化指標HA和脾臟質量指數較正常組變化差異有顯著性，肝組織HE和Masson染色病理分析證實肝纖維化已形成。

抑制HSC的活化與增殖是預防和治療肝纖維化的主要策略之一。ART是青蒿素的衍生物，體外實驗表明，ART能夠使活化的HSC發生凋亡[14]，促凋亡機制是通過抑制細胞外基質的產生及激活或抑制一些信號通路，從而發生一定的級聯效應。目前，ART可作用于HSC中TGF-β1/Smad、NF-κB、Wnt/β-catenin及TNF-α等介導的信號通路[14]。研究顯示，多細胞寄生蟲或含有殼多糖的病原體刺激上皮細胞分泌的殼多糖酶樣蛋白CHI3L1在炎癥與組織重塑中起著極其重要的作用，是巨噬細胞分化成熟的標志[15]，被激活的巨噬細胞進一步活化HSC，并使之出現肌成纖維細胞樣表型轉化，激活后的HSC可自分泌TGF-β1等細胞因子使活化得以持續，最終導致纖維化。本研究以血吸蟲性肝纖維化小鼠為動物模型，探究了ART體內抗肝纖維化的作用。模型組肝臟中維持細胞外基質合成與降解動態平衡的關鍵因子TIMP-1和Col3α1表達明顯增加，ART處理后兩因子表達量明顯降低。與模型組比較，ART處理后小鼠肝臟CHI3L1和ERK1/2蛋白的磷酸化水平明顯降低，說明ART可能通過抑制CHI3L1/ERK信號通路介導抗血吸蟲性肝纖維化。

綜上所述，ART在體內對血吸蟲性肝纖維化具有保護作用，其機制可能與膠原蛋白合成抑制以及CHI3L1/ERK信號通路的傳導抑制有關。本研究為ART抗肝纖維化的藥物研究提供了新的理論基礎。

(致謝：感謝中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所惠贈吡喹酮。感謝浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室和浙江省醫學生物工程疫苗重點實驗室的老師、同學對本研究的支持與協助。)