基于脂質代謝組學評價五味子素B誘導的急性高甘油三酯血癥小鼠模型

王曉艷，儲著勝，張 輝，張書琦，潘思源，唐進法，高錦明

(1. 河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450000；2. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；3. 浙江中醫藥大學學生處，浙江 杭州 310053；4. 河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450008；5. 香港科技大學生命科學部，香港 999077)

高脂血癥是指血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoproteincholesterol，LDL-C)升高或者高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoproteincholesterol，HDL-C)降低的一種脂代謝異常性疾病，亦被稱為脂質異常血癥[1]。高脂血癥是諸多疾病的重要誘因，包括動脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗死等。因此，降脂藥物的開發越來越受到人們的重視，而制備與臨床疾病相近似、穩定性好、可行性高、適用性和可控性強、簡單易行的適合于降血脂藥物研究，尤其是藥物篩選的動物模型尤其重要。目前，制備高脂血癥模型的常用動物包括鼠類、兔、豬等，造模方法包括高脂飼料喂養法[2]、脂肪乳劑灌胃法[3]、復合因素造模法[4]、Triton WR-1339肌肉注射法[5]等。最常用的造模方法是給動物喂養高脂飼料，但高脂飼料配方不統一，有的含有化學藥品。模型主要的表現是血TC升高，而TG升高不明顯，甚至降低，而且制備流程繁瑣和耗時較長。

五味子素B(schisandrin B，Sch B)作為傳統中藥五味子中含量最高的聯苯環辛烯類木脂素，具有解毒保肝[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]等藥理作用。前期研究發現，Sch B(0.1～2 g·kg-1)一次給藥，在12～96 h內就能很好地模擬臨床高脂血癥-脂肪肝-肝損傷的發病過程，并為降血脂藥非諾貝特所逆轉[10-11]。脂質代謝組學是研究脂質代謝調控的新學科，能夠從系統分子水平上對生物體內的脂質類代謝產物進行研究，進而分析整體脂質代謝輪廓的變化[12]。因此，本研究利用脂質代謝組學技術，進一步闡明Sch B誘發高甘油三酯血癥小鼠血清脂質代謝物的改變，篩選相關差異代謝物，為新模型提供脂代謝組學實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用儀(UPLC-Q/TOF-MS，美國Waters公司)；真空離心濃縮儀(miVac Duo，英國GeneVac公司)；分析天平(Mettler Toledo AL204，瑞士梅特勒-托利多公司)；低溫臺式高速離心機(Neofuge 1600R，上海力申科學儀器有限公司)。Sch B，香港科技大學高錦明教授提供，純度大于95%；甲醇和乙腈均購于北京化工廠；氯仿購于美國Sigma；TC試劑盒和TG試劑盒，均購自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 動物分組與給藥ICR小鼠，♂，體質量(23～27) g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。高脂/糖飼料配方：基礎飼料80%、豬油10%、果糖10%，加水適量，充分混勻，浸泡過夜，捏成適當大小的塊狀，自然晾干，備用。

小鼠分4組，每組10只，分別為正常飼料(normal diet，ND)組、ND+Sch B組、高脂高糖飼料(high fat/fructose diet，HFFD)組、HFFD+Sch B組。各組小鼠分別用正常飼料和高脂高糖飼料喂養10 d，根據前期研究結果，選擇最大效應劑量的Sch B(2 g·kg-1，其有效劑量為0.1～2 g·kg-1，一次給藥的最大耐受量大于5 g·kg-1)用橄欖油配制，于d 8灌胃給藥，對照組用橄欖油(5 mL·kg-1)灌胃。48 h后，小鼠眼眶取血，存放EP管中，靜置2 h，4 ℃、3 500 r·min-1離心8 min，取上部血清，-80 ℃保存。

1.3 生化學檢測取血清，按照試劑盒說明書操作，檢測血清TG和TC含量。

1.4 血清樣本前處理與UPLC-Q/TOF-MS分析條件取各組小鼠血清100 μL置1.5 mL離心管中，加入蛋白沉淀劑氯仿 ∶甲醇=3 ∶1(V/V)500 μL，渦旋提取5 min后，常溫靜置10 min，低溫(4 ℃)12 000 r·min-1離心5 min。取上清100 μL，離心濃縮，以100 μL異丙醇 ∶乙腈=1 ∶1(V/V)進行復溶。采用同樣的處理方法制備質量控制(quality control，QC)樣本。

色譜分離條件：分離系統中采用色譜柱Waters UPLC CSH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫設定為50 ℃。流動相A為乙腈 ∶水=4 ∶6(V/V)，其中含0.1%甲酸和10 mmol·L-1甲酸銨；流動相B為乙腈 ∶異丙醇=9 ∶1(V/V)，其中含0.1%甲酸和10 mmol·L-1甲酸銨。流速：0.3 mL·min-1，進樣量為2.0 μL。采用梯度洗脫，0～1 min，40% B；1～16 min，40%～100% B；16～18 min，100% B；18～20 min，100%～40% B；20～22 min，40% B。

質譜檢測參數：采用Xevo G2-S Q/TOF-MS質譜系統，電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)正負兩種模式，各氣路均使用氮氣；掃描范圍：m/z 50～1 200，分辨率設定為30 000。錐孔電壓：35 V；離子源溫度120 ℃；毛細管電壓：3200V(+)/2500V(-)；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流速：800 L·H-1；圓錐氣流速：50 L·H-1。

1.5 數據處理使用Masslynx 4.1數據管理軟件采集，將LC/MS分析得到的數據導入Progenesis QI軟件，對數據進行讀取、色譜峰自動識別、峰匹配等一系列處理，再將得到的數據導入SIMCA-P 13.0軟件進行(正交)偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)。OPLS-DA分析后，取VIP值大于1的所有數據進行顯著性統計分析，兩組間樣本比較采用t檢驗，P<0.05的代謝物即可能為潛在的差異代謝物。

2 結果

2.1 建立高脂血癥動物模型Tab 1結果顯示，ND+Sch B組小鼠血清TG水平是ND組的3.71倍(P<0.01)，TC水平無明顯變化。與ND組比，HFFD組小鼠血清TC水平明顯升高18.18%(P<0.05)，TG水平無明顯變化。與HFFD組比，HFFD+Sch B組小鼠血清TG水平是前者的4.17倍(P<0.001)，雖然TC水平升高16.67%，但無統計學意義(P>0.05)。與ND組比，HFFD+Sch B組小鼠血清TG和TC水平分別升高267.46%和37.88%(P<0.01)。

Tab 1 Changes of serum lipids in

*P<0.05,**P<0.01vsND;##P<0.01vsHFFD

2.2 建立脂質代謝組學方法為了盡可能地測定血清中所有脂質成分，采用正負離子兩種檢測模式，并對樣本的提取方法、色譜分離條件和質譜檢測條件進行了優化，建立的方法可檢測到血清中磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)、神經鞘磷脂(sphingomyelin，SM)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、膽甾醇酯(cholesteryl ester)、TG等脂質分子。利用ESI正、負離子模式分別采集各組小鼠血清樣本數據，獲取血清樣本的總離子流圖。Fig 1、2顯示，PE主要集中在0～4 min內洗脫，PI主要集中在4～8 min內洗脫，SM和PC主要集中在8～14 min內洗脫，而TG和膽甾醇酯主要集中在15～18 min內洗脫。所有代謝物在20 min內均能得到很好的分離，且4組的輪廓明顯不同，由此說明本研究所建立的脂質代謝組學方法可行，較為全面地反映了各組小鼠血清中的主要脂質類成分的變化。

2.3 脂質代謝組學表征用半定量數據所得矩陣，建立正交偏最小二乘判別分析模型(OPLS-DA)區分ND組(a)和ND+Sch B(b)組小鼠的脂質代謝輪廓圖。正離子模式下模擬的擬合參數為R2X=0.940，R2Y=0.981，Q2=0.959；負離子模式下模擬的擬合參數為R2X=0.923，R2Y=0.998，Q2=0.960，說明擬合得到的模型較好。OPLS-DA模型得分圖見Fig 3A、3C。結果顯示，ND組和ND+Sch B組存在明顯的區分，說明這2組小鼠的血清脂質代謝輪廓圖差異存在顯著性。

采用OPLS-DA區分ND組(a)、HFFD組(c)、HFFD+Sch B組(d)小鼠的脂質代謝輪廓圖，正離子模式下模擬的擬合參數R2X=0.951，R2Y=0.914，Q2=0.868，說明擬合得到的模型較好。負離子模式下模擬的擬合參數為R2X=0.890，R2Y=0.807，Q2=0.431。OPLS-DA模型得分圖見Fig 3B、3D。結果顯示，ND組、HFFD組和HFFD+Sch B組存在明顯的區分，說明這3組小鼠的血清脂質代謝輪廓圖差異存在顯著性。

2.4 差異化合物的分析通過OPLS-DA載荷圖和單因素方差分析尋找Sch B誘導高脂血癥的差異代謝物，依據代謝產物的精確質量數查詢HMDB(http://www.hmdb.ca)和LIPID MAPS(http://www.lipidmaps.org)等數據庫，對差異性脂質分子進行結構歸屬。結果發現，ND+Sch B組TG(54 ∶4)、TG(54 ∶3)、TG(52 ∶4)、TG(54 ∶6)、TG(54 ∶2)、TG(54 ∶7)、TG(56 ∶7)、TG(50 ∶3)、TG(56 ∶5)、TG(50 ∶2)、TG(58 ∶8)、TG(56 ∶8)、TG(58 ∶9)、TG(56 ∶4)、TG(58 ∶10)、TG(50 ∶4)、TG(56 ∶3)、TG(52 ∶6)、PC(18 ∶0/18 ∶2)、PC(18 ∶1/18 ∶0)、PC(18 ∶2/16 ∶0)、PC(18 ∶1/20 ∶3)、PC(18 ∶1/16 ∶0)、PC(18 ∶2/0 ∶0)、PC(20 ∶4/16 ∶0)、PE(22 ∶6/0 ∶0)含量高于ND組，PE(18 ∶0/0 ∶0)含量低于ND組；HFFD組SM(d18 ∶1/16 ∶0)、PC(18 ∶1/18 ∶0)、Cholesteryl ester(20 ∶4)、SM(d16 ∶1/20 ∶0)、Cholesteryl ester(22 ∶6)、PC(18 ∶2/P-18 ∶1)、PC(O-16 ∶0/20 ∶4)、PC(22 ∶4/18 ∶1)、PC(18 ∶0/22 ∶5)、SM(d18 ∶2/18 ∶0)、PI(18 ∶0/20 ∶4)、TG(54 ∶1)、SM(d18 ∶2/16 ∶0)、PC(P-16 ∶0/20 ∶4)、SM(d16 ∶1/22 ∶0)、SM(d18 ∶1/20 ∶0)、TG(52 ∶1)、PC(18 ∶1/20 ∶3)、PC(20 ∶4/16 ∶0)、PC(18∶0/18 ∶1)、PC(18 ∶2/18 ∶0)、PC(22 ∶6/18 ∶0)含量高于ND組，TG(54: ∶)、TG(52 ∶4)、TG(54 ∶7)、PC(20 ∶3/0 ∶0)、PC(22 ∶6/0 ∶0)含量低于ND組；HFFD+Sch B組TG(54 ∶3)、TG(52 ∶4)、TG(54 ∶2)、TG(54 ∶6)、PC(18 ∶1/18 ∶0)、TG(52 ∶1)、TG(50 ∶2)、TG(50 ∶3)、TG(54 ∶7)、TG(54 ∶1)、TG(56 ∶5)、TG(56 ∶8)、TG(58 ∶8)、TG(50 ∶4)、TG(56 ∶4)、20 ∶4 Cholesteryl ester、PC(18 ∶2/18 ∶0)、PC(18 ∶1/16 ∶0)、PC(18 ∶0/18 ∶1)、PC(18 ∶2/16 ∶0)、PE(22 ∶6/0 ∶0)、PC(22 ∶6/18 ∶0)、PE(18 ∶2/0 ∶0)、PE(16 ∶0/0 ∶0)含量高于HFFD組，PE(18 ∶0/0 ∶0)含量低于HFFD組。

Fig 1 Chromatogram of serum samples on positive ion mode(n=8)

A: ND group; B: ND+Sch B group; C: HFFD group; D: HFFD+Sch B group.

Fig 2 Chromatogram of serum samples on negative ion mode

A: ND group(n=6); B: ND+Sch B group(n=4); C: HFFD group(n=4); D: HFFD+Sch B group(n=4).

3 討論

目前臨床上將高脂血癥分為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、混合型高脂血癥、低高密度脂蛋白血癥。脂質作為生物體內重要的化合物，美國在“脂質代謝途徑研究計劃”中將其分為8類，分別為甘油脂類、鞘脂類、固醇脂類、脂肪酸類、甘油磷脂類、孕烯醇酮脂類、糖脂類、多聚乙烯類[13]。其復雜多樣性決定了其很難用一種方法將所有脂類物質檢測清楚。脂質代謝組學是目前新興的代謝組學的一個分支，其主要針對機體內所有脂類物質進行系統研究，應用此方法對相關疾病的發病機制的研究更為敏感、完整和準確，并能進一步反映其內源性代謝物的量變與質變，為包括高脂血癥在內的多種代謝性疾病的研究提供了重要手段，同時也成為評價高脂血癥動物模型的有效方法。前期研究發現，Sch B一次大劑量給藥對小鼠血清TG有明顯的升高作用，并伴有肝細胞脂肪樣變和肝損傷[11]，具有制備高脂血癥(急性單純性高甘油三酯血癥)動物模型的潛力。因此，本實驗借助于脂質代謝組學技術對Sch B誘導的高脂血癥進行評價，并為該模型的建立提供新的實驗依據。作為對比，同時模擬人高脂高糖飲食嗜好，在正常飼料的基礎上添加豬油和果糖制備高脂血癥，以及在此基礎上進一步觀察Sch B對脂質代謝組學的影響。

UPLC-Q-TOF-MS技術因其具有高分辨力、高靈敏度、高選擇性等優點，非常適合復雜生物代謝物的脂質組學的分析，是目前應用最為廣泛的分析技術之一。代謝組學分析產生的數據信息含量豐富，并且是多維數據，對此數據的分析需要運用化學計量學及多元統計分析方法，對采集的原始數據進行壓縮降維并歸類分析。常用的分析方法主要包括主成分分析(principal component analysis，PCA)、層次聚類分析(hierarchical clustering analysis，HCA)、非線性影射(nonlinear mapping，NLM)等非監督分類方法，以及偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)、OPLS-DA、神經網絡(neural network，NN)、k-最近鄰法(k-nearest neighbor，KNN)、隨機森林分析(random forest analysis，RF)等監督分類法。其中以PCA、PLS-DA、OPLS-DA使用最為廣泛。并且OPLS-DA是在PLS-DA基礎上發展而來的算法，與PLS-DA相比較而言，其將X變量中的系統變異分解為兩部分，隨著正交變異組分的增加，將提供更多的解釋性和減少結果的誤差。本實驗采用監督模式的OPLS-DA分析，在明確樣品分類的情況下，其分類效果比PCA更好。本研究結果證明，Sch B建立的高甘油三酯血癥與高脂高糖飲食引起的高膽固醇血癥，在脂代謝組學方面有明顯的不同。

Fig 3 OPLS-DA score plots of serum samples

A and B represent the score plots on positive ion mode; C and D represent the score plots on negative ion mode. a: mice fed with ND; b: mice fed with ND and treated with Sch B; c: mice fed with HFFD; d: mice fed with HFFD and treated with Sch B.

通過對比高分辨的質量數和相關質譜碎片裂解信息，并結合HMDB、METLIN、LIPID MAPS等數據庫，確定可能的歸屬和結構鑒定，篩選Sch B誘導高甘油三酯血癥的差異代謝物。與生化檢測結果中HFFD組小鼠血清TG水平與ND組無明顯差異結果不同，脂質代謝組學顯示出其代謝特征存在明顯不同。進一步說明與生化試劑盒檢測方法相比，脂質代謝組學能更敏感、更完整、更準確地反映其內源性脂代謝物的量變，這與文獻報道一致[14]。

綜上所述，該模型制備操作簡便，Sch B一次灌胃在12～96 h內便可復制臨床高脂血癥-脂肪肝-肝損傷的發病過程。克服高脂飼料喂養造模的繁瑣和模型不穩定的缺點，并能根據研究需要通過劑量的加減來控制模型的嚴重程度。Sch B單獨給藥升高血TG水平，可制備高甘油三酯血癥動物模型。聯合高脂高糖飲食可同時升高血TG和TC水平，制備混合型高脂血癥動物模型。本文通過脂質代謝組學的研究，豐富了Sch B制備高甘油三酯血癥動物模型的內涵和理論基礎。

(致謝：本實驗在北京中醫藥大學中藥學院中藥藥理實驗室和河南中醫藥大學第一附屬醫院中藥藥代動力學實驗室開展，感謝各位老師和同學的幫助。)