基于代謝組學研究厚樸遠志配伍醇提物對尿液代謝物的影響

馬 榮，謝 倩，王 建，黃立華，唐進法，李偉霞，馬 驍，陳 念，董泰瑋

(1. 成都中醫(yī)藥大學藥學院中藥材標準化教育部重點實驗室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137；2. 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，河南 鄭州 450000)

遠志，首載于《神農本草經》：能利九竅，益智慧，耳目聰明，不忘，強志倍力。但大劑量使用遠志，可導致惡心、嘔吐、腹脹等不良反應[1]。課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，生遠志可導致胃腸動力障礙，同時伴隨胃黏膜損傷，具有出血點等不良反應，尤以醇提物及70%乙醇洗脫部位所致胃腸毒副作用最為明顯[2]。針對遠志所致的胃腸毒副作用，課題組前期原創(chuàng)性篩選出行氣消積藥厚樸2倍于遠志(2 ∶1配比)時，可明顯緩解遠志所致的胃腸動力障礙，并保存其安神益智、祛痰的功效[3]。然而，厚樸緩解遠志所致胃腸動力障礙機制仍需探索。

代謝組學將機體作為一個完整的系統(tǒng)，觀測藥物對機體的整體代謝輪廓的影響，與中醫(yī)整體觀的理念吻合，為闡釋藥物作用機制提供了技術手段[4]。因此，本實驗采用超高效色譜串聯(lián)質譜(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS)，研究厚樸遠志配伍對大鼠尿液中代謝物的影響，借以探討厚樸緩解遠志所致胃腸動力障礙的可能機制，為揭示“相殺”配伍關系的科學內涵提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑厚樸、遠志藥材，購于成都荷花池中藥材市場，經成都中醫(yī)藥大學盧先明教授鑒定為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd. et Wils.的干燥干皮及遠志科植物遠志PolygalatenuifoliaWilld.的干燥根，依據(jù)2015年版《中國藥典》(一部)規(guī)定方法，測得厚樸中和厚樸酚(1.86%)與厚樸酚(2.55%)含量共為4.41%，遠志中細葉遠志皂苷含量為6.73%，均符合其含量要求。厚樸、遠志飲片打粉，過三號篩，分別用10倍量90%乙醇回流提取3次，每次2 h，過濾并合并濾液，分別減壓濃縮干燥得厚樸、遠志浸膏，計算得膏率分別為25.41%和48.59%。分別稱取厚樸、遠志浸膏11.12 g、10.63 g，用5%吐溫80溶液研磨，配制成分別含175 g·L-1、87.5 g·L-1的厚樸、遠志醇提物供試液，即給藥劑量分別為相當于原生藥量厚樸3.50 g·kg-1和遠志1.75 g·kg-1。配伍供試液為兩單藥混合后研磨配制而成，制備方法與單味藥相同。聚山梨酯-80(吐溫80，成都市科隆化學品有限公司，批號2017111401)；甲酸、乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器ACQUITY I-Class UPLC超高效液相色譜-Xevo G2-XS型四級桿-飛行時間質譜聯(lián)用儀(美國Waters公司，含MassLynx 4.1工作站)；Neofuge 1600R低溫離心機(上海力申科學儀器有限公司)；Vortex3渦旋混勻器(德國IKA公司)；JA5003電子分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；ULT1386-3-V-80 ℃冰箱(美國賽默飛Revco公司)。

1.3 實驗動物SD大鼠，♂，SPF級，體質量(200±20)g，購于四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所，合格證號：SCXK(川) 2013-15。實驗場地為成都中醫(yī)藥大學，國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級科研實驗室(NO:TCM-09-315)及河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，中藥臨床評價技術河南省工程實驗室。本文涉及的動物實驗經成都中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，批準號TCM-2016-312。

2 方法

2.1 動物的分組及給藥將大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，按體質量隨機分為對照組、厚樸組(3.50 g·kg-1)、遠志組(1.75 g·kg-1)、配伍組(3.50+1.75 g·kg-1)，每組10只，各組均按20 mL·kg-1灌胃相應藥液(給藥劑量系前期胃腸動力實驗研究結果，另文發(fā)表)，對照組給予同體積5%吐溫80，連續(xù)給藥3 d。

2.2 尿樣的收集和處理參考文獻方法[5]，收集末次給藥后24 h的尿樣，于接尿管中提前加入50 μL質量濃度為10 g·L-1疊氮鈉作為防腐劑，采集過程中保持冰浴，收集的尿樣放置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｄ蛞禾幚頃r，200 μL尿樣加入600 μL預冷的甲醇，渦旋3 min，4 ℃、14 000 r·min-1離心10 min，取上清液進樣分析。同時，精密量取每個尿液樣品10 μL，混合后按照上述過程進行處理作為質量控制樣品(quality control，QC)，在實驗過程中每隔10個樣品進樣1次QC，以確保整個實驗過程中儀器的穩(wěn)定性。

2.3 檢測條件

2.3.1色譜條件 參考文獻方法[5]，樣品溫度為4 ℃，柱溫40 ℃，流動相：乙腈(A)、0.1%甲酸水(B)，流速0.5 mL·min-1，運行時間12 min，進樣量4 μL。流動相洗脫梯度：0～4 min，2%～20% A；4～8 min，20%～95% A；8～8.1 min，95%～99% A；8.1～9 min，99% A；9～10 min，99%～100% A；10～10.1 min，100%～2% A；10.1～12 min，2% A。

2.3.2質譜條件 參考文獻方法[5]，采用電噴霧電離(ESI) 離子源進行正負離子模式下的代謝物的檢測，采集范圍m/z：50～1 200；源溫度110 °C；毛細管電壓1.5 kV; 采樣錐電壓40 V；去溶劑化氣流速800 L·h-1；去溶劑化氣溫度500 ℃; 錐孔氣流速50 L·h-1; 掃描時間0.15 s，掃描間延遲時間0.02 s；流速4.5 mL·min-1，用亮氨酸腦啡肽和甲酸鈉校正儀器。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析將所得樣本數(shù)據(jù)通過軟件Progenesis QI V2.0進行提取。通過全掃描模式提取荷質比在50～1 200的離子信息，記錄其保留時間，并采用SIMCA-P 14.0對提取的數(shù)據(jù)進行多元分析。采用無監(jiān)督模式的主成分分析(principal components analysis，PCA)對各給藥組分別進行分類，并評價所建立模型的效率。進一步采用偏最小二乘法-判別分析(partial least squares-discriiminate analysis，PLS-DA)對各給藥組進行監(jiān)督性分類，繪制Loading plot，選取p(corr)絕對值≥0.5及變量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)值≥1.0的變量。將所選取的變量采用單因素方差分析，并計算差異倍數(shù)(fold changes，F(xiàn)C)，選定差異具有顯著性P<0.05及FC≥1.5作為代謝標志物。將代謝標志物與人類代謝組數(shù)據(jù)庫(Human Metabolome Database，HMDB)進行比對鑒定，并采用MetPA(http://www.metaboanalyst.ca/)進行通路分析。

3 結果

3.1 大鼠尿液代謝物的輪廓分析

3.1.1正離子模式下的不同給藥組間尿液樣本的分類情況 正離子模式下，PCA得分圖(Fig 1A)表明，對照組、遠志組、厚樸組及配伍組4組間的代謝物差異無法區(qū)分，因此采用PLS-DA進一步分析4組的尿液代謝物情況。PLS-DA得分圖(Fig 1B)表明，對照組(黃色)、遠志組(紅色)、厚樸組(綠色)與配伍組(藍色)能夠明顯區(qū)分，提示遠志、厚樸及其配伍對大鼠尿液代謝物產生了明顯的影響。載荷圖(Fig 1C)進一步展現(xiàn)了擬合模型中的整體代謝物在各組間的分布水平，距離原點越遠的點對4組的分類貢獻越大。PLS-DA模型響應結果置換圖(Fig 1D)顯示，R2、Q2值均小于原始值(R2=0.588，Q2=-0.555)，證明模型有效。S-Plot(Fig 1E)中距離原點越遠的代謝物對組間分類貢獻越大；VIP圖(Fig 1F)顯示每個代謝物對分組所起的貢獻值。本次研究通過VIP≥1.0、p(corr)≥0.5或p(corr)≤-0.5共篩選出203個特征代謝物。

3.1.2負離子模式下的不同給藥組間尿液樣本的分類情況 負離子模式下，PCA得分圖(Fig 2A)顯示，對照組、遠志組、厚樸組及配伍組間的代謝物差異尚可明顯區(qū)分；在PLS-DA模式下(Fig 2B)，對照組(黃色)、遠志組(紅色)、厚樸組(綠色)、配伍組(藍色)4組間能夠明顯區(qū)分，提示對照組、3組給藥組間的代謝成分有明顯的區(qū)別。載荷圖(Fig 2C)中距離原點越遠的點對4組的分類貢獻越大。PLS-DA模型響應結果置換圖(Fig 2D)中R2、Q2值均小于原始值(R2=0.574，Q2=-0.469)，證明模型有效。S-Plot圖(Fig 2E)中距離原點越遠的代謝物對組間分離貢獻越大；VIP圖(Fig 2F)顯示每個代謝物對分組所起的貢獻值。由VIP≥1.0、p(corr)≥0.5或p(corr)≤-0.5共篩選出390個特征代謝物。

3.2 特征代謝標志物的鑒定基于VIP值及p(corr)的篩選結果，將正、負離子模式中的特征代謝物分別采用One-way ANOVA分析計算組間P值，計算4組間標準化的峰面積均值，比較各組間的FC，選取P<0.05及FC≥1.5的代謝物作為特征代謝標志物，并將其導入HMDB，最終共鑒別出2-氨基苯甲酸、D-葡萄糖醛酸-6,3-內酯、3-甲氧基-4-羥基苯乙醛等16個代謝物(Tab 1)。同時，計算16個代謝物在10個QC樣本中含量的RSD為1.94%～6.50%，提示儀器穩(wěn)定性較好，數(shù)據(jù)結果較為可靠。

3.3 特征代謝標志物的通路分析將Tab 1中的代謝物的HMDB號輸入MetPA進行通路分析。由Fig 3、Tab 2可知，厚樸配伍遠志緩解遠志所致胃腸動力障礙的作用機制可能與酪氨酸代謝、色氨酸代謝，以及苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成等14條代謝通路有關。結合文獻報道以及KEGG通路分析，酪氨酸代謝、色氨酸代謝、初級膽汁酸生物合成和維生素B6代謝可能是其主要相關代謝通路(Fig 4)。

Fig 1 Distribution of urinary metabolic components between different administration groups in positive ion mode

A: PCA score plot; B: PLS-DA score plot; C: Loading plot; D: Response replace-ment graphs of PLS-DA model; E: S-plot; F: VIP plot. PT:Polygalatenuifolia; MO:Magnoliaofficinalis.

Fig 2 Distribution of urinary metabolic components between different administration groups in negative ion mode

A: PCA score plot; B: PLS-DA score plot; C: Loading plot; D: Response replace-ment graphs of PLS-DA model; E: S-plot; F: VIP plot.

4 討論

課題組前期研究表明，厚樸遠志2 ∶1配伍可明顯緩解遠志所致的胃腸動力障礙[6]，厚樸中的酚類物質可抑制遠志中皂苷類成分在腸道的吸收，遠志可促進厚樸中酚類物質的溶出而促進其發(fā)揮促胃動力的療效，但其深層次生物機制尚不清楚。本研究基于前期研究結果，以中醫(yī)整體觀為指導，采用UPLC-Q-TOF-MS結合多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法，進一步從整體代謝輪廓探討厚樸緩解遠志胃腸動力障礙作用機制，結果表明，其可能與酪氨酸代謝、色氨酸代謝、初級膽汁酸生物合成和維生素B6代謝等通路相關。除此以外，考慮到♀大鼠生理期對體內代謝物的影響，本次實驗均選用♂大鼠作為實驗對象。

酪氨酸可代謝為多巴胺和去甲腎上腺素，均為人體內重要的神經遞質，以多巴胺為介質的腦-腸軸對調節(jié)胃腸功能具有重要作用。研究表明，腸系膜器官可產生的大量的多巴胺，抑制胃體、胃竇運動[7]。多巴胺可在酶的作用下降解為香草酸，去甲腎上腺素則降解為香草扁桃酸。本次研究結果顯示，遠志可導致該代謝過程中的中間代謝產物3-甲氧基-4-羥基苯乙醛、香草乙二醇降低，以及酪氨酸代謝終產物2-羥基-3-(4-羥基苯基)丙烯酸極明顯升高，提示遠志可引起酪氨酸代謝紊亂，配伍厚樸可明顯回調上述代謝物的變化。同時，研究表明[8]，厚樸中厚樸酚可抑制酪氨酸酶活性，和厚樸酚可抑制乙酰膽堿誘導的多巴胺的分泌。由此推測，遠志可能導致酪氨酸紊亂，抑制多巴胺的分解代謝，導致多巴胺含量升高增多，進而引起胃腸動力障礙，厚樸可能通過抑制多巴胺的分泌，進而緩解遠志所致的胃腸動力障礙。

Tab 1 Identification of characteristic metabolic markers in different drug-administered groups

a: Tyrosine metabolism; b: Tryptophan metabolism; c: Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis; d: Biosynthesis of unsaturated fatty acids; e: Fatty acid biosynthesis; f: Primary bile acid biosynthesis; g: Ascorbate and aldarate metabolism; h: Vitamin B6 metabolism; i: Phenylalanine metabolism; j: Pentose and glucuronate interconversions; k: Starch and sucrose metabolism; l: Fatty acid elongation in mitochondria; m: Valine, leucine and isoleucine degradation; n: Fatty acid metabolism(same as in Fig 3).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsPT group; - indicates no FC value.

色氨酸在體內可被分解代謝為5-羥色胺(5-HT)，5-HT是一種的重要神經遞質和旁分泌信號分子，主要參與調節(jié)腸道的蠕動和分泌功能，可直接作用于腸神經元及肌細胞等效應器參與腸道蠕動反射[9]。5-HT可代謝為血清素，進而轉化為褪黑素，參與體內調節(jié)腸道動力、腸道免疫、腸道分泌等過程[10]。褪黑素在肝臟中進一步代謝為6-羥基褪黑素與5-甲氧基吲哚乙酸，其中，6-羥基褪黑素具有強抗氧化作用，可通過抗炎和免疫調節(jié)保護上消化道。若褪黑素代謝發(fā)生紊亂，則會影響到胃腸道正常消化功能。Cezary等[11]研究發(fā)現(xiàn)，消化功能不良患者血清中褪黑素濃度明顯升高，尿樣中6-硫酸基褪黑素排泄明顯降低。本實驗結果顯示，遠志組大鼠尿液中5-甲氧基吲哚乙酸水平升高，6-羥基褪黑素明顯下降，提示遠志導致色氨酸代謝紊亂，配伍厚樸可明顯回調該代謝物的變化。另有研究表明[12]，厚樸中厚樸酚與和厚樸酚可劑量依賴性地抑制5-HT所致的平滑肌收縮。以上提示，遠志可能導致色氨酸代謝過程中5-HT的代謝紊亂，進而引起胃腸動力障礙，厚樸可能通過調節(jié)色氨酸代謝，緩解遠志所致胃腸動力障礙。

Tab 2 Information of metabolic pathway

Match status: the number of identified metabolites/the total number of metabolites in the pathway; P: the raw P value obtained by pathway analysis; Impact: the pathway impact value obtained by topological analysis.

Fig 3 Pathway analysis of characteristic metabolic markers with MetPA

膽汁酸是膽汁的主要成分，在人體內，膽汁酸通過腸肝循環(huán)，可以乳化脂肪，促進疏水性營養(yǎng)素的消化和腸吸收。肝細胞以膽固醇為原料直接合成的膽汁酸稱為初級膽汁酸。3a,7a,12a-三羥基-5b-膽甾烷酸是初級膽汁酸經典合成途徑中重要中間代謝物。膽汁酸的合成代謝與肝、腸及膽道系統(tǒng)密切相關，部分膽汁酸可以調節(jié)胃腸運動[13]。若發(fā)生胃腸道疾病如腹瀉等，則會導致腸肝循環(huán)受阻，進而導致膽汁酸合成代謝紊亂，其代謝途徑中關鍵酶的活性下降或缺失，大量膽固醇和膽甾烷醇則通過尿液、糞便排出[14]。本次實驗過程中，遠志組大鼠出現(xiàn)胃腸脹氣、胃腸動力不足，以及拉稀、毛色無光澤等現(xiàn)象，提示遠志可能破壞膽汁酸肝腸循環(huán)。檢測結果表明，遠志組大鼠尿液中3a,7a,12a-三羥基-5b-膽甾烷酸明顯升高，并檢測到新代謝物3a,7a,12a-三羥基-5b-膽甾-4-烯，配伍厚樸可回調上述代謝物的變化。以上提示，遠志導致胃腸動力障礙可能與破壞膽汁酸的肝腸循環(huán)，進而引起初級膽汁酸的生物合成紊亂有關，厚樸可能通過調控該過程，緩解遠志引起的胃腸動力障礙，這或許與厚樸“行氣，促消化”有關。

另有研究表明[15]，維生素B6可通過減少乙酰膽堿的釋放抑制胃腸蠕動，解除內臟平滑肌痙攣，從而緩解阿奇霉素導致的胃腸不適。本研究顯示，遠志組與對照組、厚樸組比較，尿液中新檢測到吡哆醇5′-磷酸鹽，而配伍后可明顯降低該代謝物水平，提示厚樸緩解遠志所致的胃腸動力障礙可能與維生素B6代謝有關。

綜上，本研究從整體輪廓提示，厚樸可能通過調控酪氨酸代謝、色氨酸代謝、初級膽汁酸生物合成和維生素B6代謝等代謝通路，緩解遠志引起的胃腸動力障礙。然而，本研究尚未對上述通路中相關分子機制進行驗證，后續(xù)將開展相關通路驗證，并采用膽汁代謝組學進一步探討厚樸緩解遠志所致胃腸動力障礙的作用機制。

Fig 4 Network diagram of the metabolic pathways Ellipse represents urinary characteristic metabolic markers; blue indicates tyrosine metabolism; orange indicates tryptophan metabolism; pink indicates primary bile acid biosynthesis; green indicates vitamin B6 metabolism. indicates control, PT, MO, PT+MO respectively. The level of the metabolite content is expressed by the color depth. If the content is 0, it is white.

[致謝：本文實驗在國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級科研實驗室(NO:TCM-09-315)及河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，中藥臨床評價技術河南省工程實驗室完成。感謝課題組成員的幫助！]