自擬通絡祛濁方對兩種不同方法誘導大鼠非酒精性單純性脂肪肝模型的干預效果及機制研究

金 毅，呂愛貞，黃寶明，邢 偉，鄭又銘，張金龍，楊 雯，徐愉林，李 靜

[1. 深圳市藥品檢驗研究院(深圳市醫療器械檢測中心)深圳藥品質量標準研究重點實驗室，廣東 深圳 518057；2. 廣東東陽光藥業有限公司東陽光科技園藥理部，廣東 東莞 523000)

非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以及肝硬化等，均屬于非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的疾病譜[1]。隨著NAFL發病率逐年增高，日趨年輕化，NAFL的防治受到重視，并從動物模型、細胞模型等多種方法研究[2-4]。但是，至今其發病機制尚不清楚，西醫無確切有效的治療方法，而中醫藥在臨床上可獲得較好的療效[5]。

中醫理論認為，NAFLD患者多為飲食不節，肥甘厚膩易積聚在脾胃，或者是情志不暢，肝絡受阻，多為自擬中藥復方進行治療，效果明顯[6]。本研究基于驅除體內氣血瘀滯的“通絡”和清除病理代謝廢物的“祛濁”理論，采用對NAFLD患者有明顯臨床療效的自擬通絡祛濁方，以防未病的理念，選擇國家食藥監總局頒布的保健食品配方中藥食同源的西洋參、麩炒白術、肉桂等6味中藥，觀察自擬通絡祛濁方對四氯化碳(tetrachloride，CCl4)化學性肝損傷或高脂飼料誘導的大鼠NAFL模型的干預效果，初步探討作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物健康清潔級SD大鼠，SPF級，♂，體質量(160～180) g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物質量合格證號：43004700039398、43004700035190，生產許可證號：SCXK(湘)2016-0002。動物飼養于廣東東陽光藥業有限公司東陽光研究院屏障環境動物實驗室，在(20～26) ℃和40%～70%濕度下飼養，采用晝夜各12 h間斷照明(實驗動物福利倫理審查號 IAEC-K-170712-01)。自擬高脂飼料配方的成分為基礎飼料50%、豆粉12.5%、蛋黃粉12.5%、豬油10%、蔗糖10%、奶粉5%、濃魚肝油10滴/100 g(委托廣東省醫學實驗動物中心配制)。

1.2 藥物共計6味中藥配方顆粒(中藥配方顆粒購自廣東一方制藥有限公司，批號：7071421、7072401、7070651、7072701、7060201、7070061)，溶于40 ℃純凈水，保證最大灌胃容積<2 mL，采用本項目組已發表論文[7]中的有效給藥劑量，即西洋參0.75 g·kg-1、麩炒白術1.5 g·kg-1、肉桂0.25 g·kg-1、桃仁1.0 g·kg-1、麩炒枳殼0.5 g·kg-1、三七0.65 g·kg-1。

1.3 試劑CCl4(AR級，阿拉丁公司，批號：E1625074)；戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司，批號：060222)；組織固定液(B型，中山市康乃欣生物醫療科技有限公司，批號：20170925)；無水乙醇、二甲苯(分析純，廣州化學試劑廠)；蘇木精染色液(批號：717094)、伊紅染液(批號：717063)，購自珠海貝索生物技術有限公司；谷丙轉氨酶(alanine transaminase， ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，CHO)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein， LDL)檢測試劑盒，均購自Roche公司；非那西汀(批號：WXBC1218V)，購自阿拉丁；雙氯芬酸鈉(批號：100334-200302)，購自中國食品藥品檢定研究院；丁呋洛爾(批號：1-EJB-67-6)，購自TRC；安非他酮(批號：100671-200301)，購自中國藥品生物制品檢定所；紫杉醇(批號：130326)，購自上海康標化學有限公司；普萘洛爾(純度>99.0%，批號BCBQ4523V)，購于美國Sigma公司；色譜柱(XbridgeTMC18，5 μm，2.1 mm×150 mm)，購于Waters公司。

1.4 儀器冷凍研磨儀(上海靜信實業發展有限公司)；VIP-5HR脫水機(櫻花醫療科技泰州有限公司)；EC360包埋機、半自動HM1401切片機(德國美康國際)；HMS740全自動染色機(IKA公司)；烤片機(Stretching Tables，MICOM，德國)；cobas c311羅氏全自動生化分析儀(德國羅氏公司)；IKA T10B 手持勻漿機(德國IKA公司)；5810R冷凍離心機(德國Eppendorf 公司)；AB sciex 4500質譜儀(美國AB SCIEX公司)；Agilent 1200型高效液相色譜儀、6530-QTOF四極桿飛行時間質譜(美國Agilent公司)。

2 方法

2.1 兩種實驗動物模型的建立CCl4模型組大鼠每周2次皮下注射含有40% CCl4的橄欖油，溶媒組皮下注射橄欖油，劑量均為2 mL·kg-1，直至實驗結束[8]。高脂飼料模型組每天給予高脂配方飼料，空白對照組給予基礎飼料。

2.2 分組及給藥方法CCl4誘導NAFL模型實驗分為溶媒組、CCl4模型組及通絡祛濁方預防組(簡稱預防組)，該模型成功率高，每組5只；高脂飼料誘導NAFL模型實驗分為空白對照組、高脂飼料模型組及預防組，每組10只。兩個預防組從實驗初始，在和模型組相同條件造模的同時，每天灌胃給予通絡祛濁方。CCl4誘導NAFL模型實驗在實驗第4周末結束，高脂飼料的實驗在第9周末結束。

2.3 血生化檢測實驗結束時，各組大鼠禁食不禁水16 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)麻醉，腹主動脈采血，4 ℃、3 500 r·min-1離心15 min，取血清，檢測ALT、AST、TG、CHO、HDL和LDL。

2.4 肝臟脂質檢測剖取肝臟后，剪取新鮮肝組織，經無水乙醇勻漿，離心取上清，測TG及CHO的濃度，計算肝內TG及CHO的含量。

2.5 組織病理學檢查剩余肝臟放入福爾馬林溶液中固定7 d，取材，脫水浸蠟，包埋，切片3～5 μm，HE常規染色后，光學顯微鏡下觀察[7]。

2.8 代謝組學測定及分析方法取血漿樣品，渦旋震蕩30 s，取100 μL樣品，加入甲醇-乙腈(1 ∶1)300 μL，再加入10 μL內標工作液，渦旋5 min混勻，18 000×g離心5 min，取上清200 μL，使用HPLC-6530Q-TOF液質聯用系統采集，后續經MassHunter，XCMS online處理及校正質譜數據，使用Metaboanalyst4.0形成PCA及sPLS-DA模型，使用Prism 7.0，Two way ANOVA (Tukey's multiple comparisons test)進行統計學分析[9-10]。主要使用KEGG分析代謝通路。

3 結果

3.1 通絡祛濁方有效改善肝臟脂肪變性

3.1.1通絡祛濁方對CCl4誘導的NAFL模型的干預效果明顯 CCl4模型組與溶媒組比較，肝臟表面色澤發黃，體積、重量增加。Fig 1的組織病理學觀察，溶媒組未見異常；模型組可見肝細胞廣泛的大泡性空泡樣改變，符合目前國際公認的NAFL的病理學診斷標準，確認CCl4誘導的NAFL模型造模成功[1, 11]。與模型組比較，預防組的肝細胞空泡樣變的程度明顯的減輕。

3.1.2通絡祛濁方對高脂飼料誘導的NAFL模型有改善作用 大體觀察，與空白對照組比較，模型組肝臟表面色澤發黃，重量增加。Fig 2的組織病理學觀察發現，空白對照組未見異常；模型組可見大空泡性脂肪變性，確認造模成功；與模型組比較，預防組空泡樣變的數量減少，病變程度減輕。

3.2 通絡祛濁方明顯降低NAFL模型中肝內脂質含量和肝臟質量

3.2.1通絡祛濁方明顯降低CCl4誘導的NAFL模型的肝內TG和肝指數 Tab 1結果顯示，與溶媒組相比，CCl4模型組大鼠肝內TG含量明顯增加(P<0.01)，預防組明顯降低肝內TG含量(P<0.05)。與溶媒組相比，模型組大鼠肝重、肝腦比均明顯增加(P<0.05)，預防組兩者均有下降趨勢。

Fig 1 Histopathological changes in liver of NAFL rats established by CCl4, intervention group and vehicle group(HE staining,×100)

A:Vehicle group; B:NAFL group; C:Intervention group.

Fig 2 Histopathological changes in liver of NAFL rats established by a high-fat diet, intervention group and control group(HE staining,×200)

A:Control group; B:NAFL group; C:Intervention group.

3.2.2通絡祛濁方明顯降低高脂飼料誘導的NAFL模型的肝內TG、CHO及肝指數 與空白對照組相比，高脂模型組肝內TG及CHO含量明顯增加(P<0.01)，預防組肝內TG和CHO含量有降低趨勢。模型組肝重有升高的趨勢，肝腦比明顯增加(P<0.05)；與模型組相比較，預防組肝腦比有下降趨勢(Tab 1)。

3.3 通絡祛濁方對動物NAFL模型的血脂具有雙向調節作用

3.3.1通絡祛濁方對CCl4誘導的模型中病理性降低的血脂有上調作用 與溶媒組相比，模型組血中TG、CHO、HDL及LDL均呈降低趨勢，特別是LDL差異有統計學意義(P<0.01)。預防組對血中的TG、CHO有升高趨勢(Tab 2)。

3.3.2通絡祛濁方對高脂飼料誘導的模型中病理性上升的血脂有下調作用 高脂飼料喂養9周后，與空白對照組相比，模型組血中TG明顯升高(P<0.01)；預防組將血中TG降至正常水平(P<0.05)。模型組血中CHO、HDL及LDL有下降的趨勢，預防組一定程度回升HDL及LDL(Tab 2)。

3.4 通絡祛濁方明顯恢復CCl4誘導的NAFL模型中CYP酶活性如Fig 3所示，與溶酶組比較，CCl4模型組各亞酶活性均明顯下降(P<0.01)，預防組各亞酶活性明顯回升，除CYP1A2之外，差異均有統計學意義。而在高脂飼料誘導的NAFL模型中，主要微粒體亞酶活性與空白對照組比較，無明顯改變。

3.5 通絡祛濁方對NAFL模型干預治療的代謝組學分析結果

Tab 1 Changes of hepatic lipids, organ weight and liver index in each group of NAFL rats established by CCl4 or a high-fat diet

*P<0.05,**P<0.01vsvehicle or control;#P<0.05vsNAFL model

Tab 2 Changes of blood lipids in each group of NAFL rats established by CCl4 or a high-fat diet/mmol·L-1

**P<0.01vsvehicle or control;#P<0.05vsNAFL model

Fig 3 Changes of CYP enzyme activity in NAFL rats established by CCl4(A) or a high-fat diet(B)

**P<0.01vsvehicle group;#P<0.05,##P<0.01vsNAFL model group

3.5.1化學計量學分析 本研究使用PCA模型觀察系統性偏差范圍。質控樣品(quality control，QC)均緊密聚集，說明在不同時間點系統穩定(Fig 4A)。CCl4模型組、預防組與溶媒組能夠基于血漿代謝產物相互分離，各組樣本之間存在系統性差異；而高脂模型組與預防組的95%置信限有一定重疊，兩組在代謝產物上有一定的相似特征(Fig 4B、4C)。

3.5.2關鍵代謝產物 CCl4誘導NAFL模型中，共篩選出6個重要的代謝產物，包括4個磷脂類物質，LysoPE(0 ∶0/14 ∶1(9Z))、PG(15 ∶1(9Z)/0 ∶0)、PG(13 ∶0/0 ∶0)、PC(16 ∶0/22 ∶5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))，以及1個氨基酸類物質，4-胍基丁酸(4-guanidinobutanoic acid)；1個不飽和脂肪烴類，1,3-辛二烯(1,3-octadiene)。以上代謝產物存在相同的變化趨勢，其中PG(15 ∶1(9Z)/0 ∶0)在溶媒組和模型組間差異有統計學意義，并且預防組恢復至溶媒組水平。同時，本實驗中，亦可見亞油酸及PC(0 ∶0/18 ∶0)在CCl4誘導NAFL模型組明顯下降(P<0.01)，并在預防組恢復至溶媒組水平(Fig 5A)。

高脂飼料誘導的NAFL模型的6個關鍵代謝產物包括3個有機酸類，(2E,4Z)-2-羥基粘康酸[(2E,4Z)-2-hydroxymuconic acid]、(E)-4-(三甲基季銨)丁-2-烯酮[(E)-4-(trimethylammonio)but-2-enoate]、2,3-羥基丁酸(2,3-dihydroxybutanoic acid)；1個反式油酸酰胺，即脂肪酰胺(elaidamide)；1個脂肪烴類化合物，19碳-3Z,6Z,9Z-三烯(3Z,6Z,9Z-eicosatriene)；1個磷脂類化合物，PC(20 ∶1(11Z)/0 ∶0)。其中，2,3羥基丁酸在模型組與空白對照組之間差異有顯著性，但預防組未完全恢復至空白對照組水平(Fig 5B)。

Fig 4 sPLS-DA score plot of metabolites

A:PCA model covering QC samples; B:sPLS-DA score plot of metabolites of NAFLD rats established by CCl4; C:sPLS-DA score plot of metabolites of NAFLD rats established by a high-fat diet. The ellipse around the periphery of each group of samples represents the 95% confidence limit.

Fig 5 Relative content of key circulating metabolites among groups

A:Relative content of key circulating metabolites among groups in NAFL rats established by CCl4(1.4-Guanidinobutanoic acid; 2. LysoPE(0 ∶0/14 ∶1(9Z))； 3. PG(15 ∶1(9Z)/0 ∶0)； 4. 1,3-Octadiene; 5. PG(13 ∶0/0 ∶0); 6. PC(16 ∶0/22 ∶5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)); 7. PC(0 ∶0/18 ∶0); 8. Linoleic acid); B:Relative content of key circulating metabolites among groups in NAFL rats established by a high-fat diet(1. (2E,4Z)-2-hydroxymuconic acid; 2. (E)-4-(trimethylammonio)but-2-enoate; 3. 2,3-dihydroxybutanoic acid；4. PC(20 ∶1(11Z)/0 ∶0); 5. Elaidamide; 6. 3Z,6Z,9Z-eicosatriene; 7. PC(0 ∶0/18 ∶0); 8. Linoleic acid).**P<0.01vsvehicle group;#P<0.05,##P<0.01vsNAFL model group.

4 討論

NAFLD較為主流的發病機制理論為“二次打擊”學說，即第1次“打擊”指脂肪酸和甘油三酯在肝細胞內的沉積，引起非酒精性單純性脂肪變性(NAFL)；第2次“打擊”造成肝臟炎癥，肝纖維化，甚至發展為肝硬化和肝癌[12]。NAFL尚屬可逆性病變，而炎癥及纖維化階段的臨床治療及病理學改變均較難恢復。因此，運用中醫防未病思想和通絡、祛濁理論干預，發現通絡祛濁方明顯降低兩種不同方法誘導大鼠NAFL模型肝細胞內脂質含量，一定程度降低肝臟質量和肝指數，對血脂有雙向調節作用，提示通絡祛濁方可作為預防干預NAFL的有效手段，改善肝脂肪變性，減緩NAFL的進展。

CYP酶活性在CCl4誘導的NAFL模型中明顯降低，預防組對各亞酶活性均有明顯提升，提示CYP酶是CCl4引發肝損傷的重要因素，與傳統的CCl4肝損傷機制相吻合。因此，CYP酶活性是通絡祛濁方干預效果的重要途徑，可作為觀察指標之一。在高脂飼料誘導的NAFL模型中，CYP酶活性幾乎無改變，說明不是高脂飼料誘導NAFL的因素，亦不參與通絡祛濁方干預作用。

雖然CCl4或高脂飼料誘導的大鼠NAFL模型均能觀察到相似的肝臟病變，但代謝組學結果顯示，這兩種不同方法引起的代謝產物變化不同。CCl4誘導的大鼠NAFL模型與磷脂類物質含量相關。在脂肪沉積于肝臟無法轉運至外部時，血中的磷脂類物質下降，并在預防組逐漸恢復至溶媒組水平，提示可能與脂代謝通路(glycerophospholipid metabolism)異常相關。由于肝臟大量脂類物質的蓄積，大量游離的脂類及脂肪酸類蓄積于肝臟，磷脂的上游合成原料，包括含有十六碳支鏈磷脂結構的上游原料，例如十六烷酸等被消耗，導致血中游離磷脂類含量下降。除磷脂類外，氨基酸類物質胍基丁酸(guanidinobutanoic acid)及脂肪烴類物質辛二烯(1,3-octadiene)也呈下降趨勢，其中胍基丁酸是精氨酸及脯氨酸代謝的關鍵下游產物。精氨酸對促進機體捕獲氨，并通過形成尿素的方式降低血中氨水平起到重要作用。胍基丁酸的下降，提示精氨酸代謝減弱，肝臟合成尿素的能力下降，排毒功能減弱。而游離辛二烯及磷脂的降低，可能與肝臟脂質蓄積導致其生物合成原料減少有關。在高脂飼料誘導的NAFL模型中，主要出現呈上升趨勢的代謝產物是游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)、脂肪酰胺、脂肪烴以及磷脂[13]。FFA占比最大(42.86%)。FFA的主要作用是作為載體，為三羧酸循環提供酰基。輔酶A(coenzyme A，CoA)在乙酰轉移酶的作用下，通過FFA獲得酰基，轉化成乙酰-CoA，然后進入三羧酸循環。作為體內能量代謝的核心環節，三羧酸循環上游的變化也提示體內能量代謝的異常，而FFA的來源主要是中性脂肪降解。結果提示，在脂肪大量攝取時，除了肝臟脂肪蓄積及游離的TG增加，血中主要增加的是脂類的降解產物FFA，說明機體攝入胺類過多，但捕獲氨的能力不足以完全排除這些額外的胺類，機體通過精氨酸、鳥氨酸代謝捕獲氨，并生成尿素的反應不足以排除血中過多的游離胺類，從而提示NAFL肝功能下降。

綜上所述，通絡祛濁方對兩種不同因素誘導的大鼠NAFL模型具有較明顯的保肝降脂的干預效果，但在不同方法誘導的NAFL中發揮干預作用的機制不同。

(致謝：本實驗在廣東東陽光藥業有限公司東莞東陽光科技園藥理部完成，感謝大力支持及協助！)