血根堿抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖、遷移和細胞周期的研究

胡 燦，金建偉，陸仲夏,3，徐志遠，倪益秀，呂 航，汪麗菁，程向東

(1. 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院，浙江 杭州 310053；2. 浙江中醫藥大學附屬第一醫院胃腸外科，浙江 杭州 310006；3. 中國海洋大學醫藥學院，山東 青島 266100；4. 浙江省腫瘤醫院超聲科，浙江 杭州 310022)

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其中有65%～70%的患者在就診時已為中晚期。藥物治療包括分子靶向治療是中晚期胃癌治療的重要手段，盡管近年來針對胃癌的新型靶向藥物研究取得了一定的進展，但普遍存在敏感性低、耐藥發生率高等問題，制約著臨床應用和療效。近年來，運用中草藥治療胃癌已成為目前國內外研究的熱點[1]。血根堿(sanguinarine，San)分子式為C20H14NO4，分子量為332，是一種苯并菲啶類生物堿，主要來源于博落回、血水草等中草藥[2]。文獻報道，血根堿具抗菌、消炎、驅蟲等多種藥理學作用，并且其抗癌作用得到了越來越多的關注[3]。本研究以胃癌SGC-7901細胞為研究對象，探究血根堿對胃癌細胞增殖、遷移及細胞周期的影響，為血根堿用于治療胃癌提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞株胃癌SGC-7901細胞為浙江中醫藥大學附屬第一醫院中心實驗室凍存。

1.2 藥物與試劑血根堿(批號BP1253)，購自成都普瑞法科技開發有限公司，用DMSO配制成2 mmol·L-1濃度，使用前，用培養基配制成所需濃度。RPMI 1640細胞培養基、胎牛血清，均購自美國Gibco公司；MTT細胞活性試劑盒，購自美國Sigma公司；細胞周期檢測試劑盒，購自康為世紀生物科技有限公司；細胞裂解液、GAPDH抗體、ECL反應液，均購自碧云天生物科技有限公司；基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin dependent kinases 4, CDK4)、p16抗體，均購自Cell Signaling Technology。

1.3 儀器FC500流式細胞儀(Beckman公司)；冷凍離心機(Eppendrof公司)；酶標儀(Thermo Scientific公司)。

2 方法

2.1 人胃癌SGC-7901細胞的培養將凍存的人胃癌SGC-7901細胞置于37 ℃恒溫水浴箱中，使其融化，移入離心管，加入5 mL RPMI 1640培養液吹打均勻，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液。加入5 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液懸浮細胞，反復吹打使細胞均勻分散，接種到培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養備用。

2.2 細胞形態學觀察將SGC-7901細胞鋪于96孔板中，培養24 h。用培養液將血根堿稀釋成不同濃度(3、6、9 μmol·L-1)，加入胃癌細胞中，正常對照組加入培養液，繼續培養24 h。置于倒置顯微鏡下，觀察其細胞形態及生長狀態。

2.3 MTT法檢測細胞活性取對數生長期的SGC-7901細胞，以每孔1×104個細胞接種于96孔板中，5% CO2、37 ℃飽和濕潤條件培養24 h。設置空白對照組(含培養液)、血根堿低、中、高濃度組(3、6、9 μmol·L-1)。加藥培養24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，避光37 ℃孵育2 h。酶標儀490 nm波長檢測吸光度，存活率%=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。該實驗重復3次。

2.4 流式細胞術檢測細胞周期取對數期的SGC-7901細胞,以1×106個每孔接種于6孔板中，培養24 h。加藥處理方式同“2.3”。繼續培養24 h，胰酶消化后，吹打混勻，收集細胞懸液，1 000 r·min-1離心后，棄上清。PBS溶液洗滌后，用500 μL 1×Binding buffer重懸，吸取100 μL重懸液于1.5 mL離心管中，向每管加入5 μL PI，室溫避光孵育15 min，1 h內進行流式細胞術檢測。

2.5 劃痕法檢測細胞遷移取對數期的SGC-7901細胞,以5×105個每孔接種于6孔板中培養。當細胞單層鋪于板底約90%時，用200 μL滅菌的槍頭垂直于孔板，輕輕劃線，每組設計3個平行孔，棄去培養液，并用PBS輕輕沖洗細胞碎片，并在倒置顯微鏡下拍照。然后加入含不同濃度血根堿(0、3、6、9 μmol·L-1)的培養液培養24 h，在倒置顯微鏡下拍照。以上實驗重復3次。愈合比%=(0 h空白面積-24 h空白面積)/0 h空白面積×100%。

2.6 Western blot檢測蛋白表達取對數生長期的胃癌細胞，以1×106個每孔接種于6孔板中，培養24 h。加藥培養24 h，收集細胞懸液，離心后棄上清。在冰上，以蛋白裂解液裂解細胞30 min，并每隔10 min振蕩混勻1次。4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清。BCA法測蛋白濃度，經SDS-PAGE電泳、轉膜后，室溫封閉2 h；TBST洗膜3次后，4 ℃一抗孵育過夜。TBST再次洗膜3次后，室溫孵育二抗2 h，TBST洗膜3次，條帶經ECL孵育后，于暗室掃膜顯影。

3 結果

3.1 血根堿對胃癌SGC-7901細胞形態的影響給藥24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。如Fig 1所示，對照組細胞生長正常，排列緊密、胃癌細胞呈菱形。血根堿處理后，胃癌細胞貼壁情況下降，細胞皺縮呈圓形，出現細胞破裂情況。血根堿能抑制胃癌細胞生長，并改變胃癌細胞形態。

Fig 1 Effect of sanguinarine on morphology of SGC-7901 cells

A: Control; B: 3 μmol·L-1sanguinarine; C: 6 μmol·L-1sanguinarine; D: 9 μmol·L-1sanguinarine.Arrows indicated cell morphology of SGC-7901 cells in gastric cancer treated with sanguinarine.

3.2 血根堿對胃癌SGC-7901細胞活性的影響Fig 2結果顯示，與對照組相比，血根堿(3、6、9 μmol·L-1)作用于胃癌SGC-7901細胞后，細胞存活率明顯降低(P<0.05)。血根堿在3～9 μmol·L-1濃度范圍內，對SGC-7901細胞的活性有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。

Fig 2 Effect of sanguinarine on cell

3.3 血根堿對胃癌SGC-7901細胞周期的影響如Fig 3所示，與對照組相比，血根堿作用人胃癌SGC-7901細胞24 h后，G1期細胞明顯增多，且呈濃度相關性。血根堿阻滯SGC-7901細胞于G0/G1期。

3.4 血根堿對胃癌SGC-7901細胞遷移的影響用倒置顯微鏡拍攝加藥0、24 h時，胃癌細胞的劃痕愈合情況。如Fig 4所示，隨著血根堿濃度的提高，細胞劃痕的愈合趨勢逐漸減弱。提示血根堿抑制胃癌SGC-7901細胞的遷移能力。

Fig 3 Effect of sanguinarine on cell cycle of SGC-7901

A: Control; B: 3 μmol·L-1sanguinarine; C: 6 μmol·L-1sanguinarine; D: 9 μmol·L-1sanguinarine; E: Quantitative map of sanguinarine on SGC-7901 cells.*P<0.05vscontrol.

*P<0.05vscontrol

3.5 血根堿對SGC-7901細胞中MMP-2、MMP-9、p16、CDK4及cyclin D1蛋白水平的影響如Fig 5所示，血根堿明顯下調胃癌細胞MMP-2、MMP-9的蛋白表達量(P<0.05)。細胞周期相關蛋白檢測結果顯示，血根堿明顯下調CDK4、cyclin D1的蛋白表達(P<0.05)，明顯上調p16的蛋白表達(P<0.05)。

4 討論

胃癌是全球第二大常見的消化系統腫瘤，近年來，其發病率和死亡率呈快速上升的趨勢[4]。目前治療胃癌的方法主要有手術和放化療，但因其價格昂貴、副作用大，并不能讓患者滿意。中藥治療胃癌已經具有數千年的臨床經驗，具有療效好、不良反應少等特點[5]。血根堿是從中藥罌粟科博落回中提取的一種成分，具有廣泛的藥理作用。血根堿能改善多種藥物引起的肝損傷。有研究表明，血根堿能刺激B淋巴細胞和T淋巴細胞增殖，增強機體免疫的功能。此外，血根堿對宮頸癌、結腸癌、舌癌等多種腫瘤具有明顯的抑制和殺傷作用，具備成為抗癌藥物的潛力[6]。國內有學者研究發現，血根堿能通過下調宮頸癌中MMP-2、MMP-9的表達，調節宮頸癌細胞的侵襲和轉移能力，并呈現一定程度的劑量依賴性[7]。

胃癌細胞的遷移與侵襲是胃癌擴散和復發的重要原因[8]。腫瘤細胞在侵襲和轉移過程中必須破壞細胞外基質(extracellular matrix，ECM)[9]。而MMP能有效降解ECM的主要成分Ⅳ型膠原[10]。因此，MMP-2及MMP-9的蛋白表達量常用于反映細胞的遷移及侵襲能力，血根堿能通過下調MMP-2和黏附蛋白(E-cadherin),抑制宮頸癌細胞的侵襲能力[11]。本研究發現，血根堿能抑制胃癌SGC-7901細胞的遷移能力，并且隨著藥物濃度的增加，抑制作用越強。通過蛋白免疫印跡法檢測遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9結果顯示，血根堿明顯下調胃癌細胞MMP-2、MMP-9的蛋白表達量，且與濃度相關，表明血根堿可能通過下調胃癌細胞的MMP-2、MMP-9的蛋白表達量，從而抑制胃癌細胞的遷移能力。

細胞周期的紊亂導致細胞過度增殖是胃癌發生的重要原因[12]。G1期與S期的節點是重要的細胞周期調控點，由細胞周期蛋白(cyclins)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinases inhibitors, CKIs)、CDKs等蛋白精準調控[13-14]。Cyclin D1與CDK4形成的cyclin/CDK激酶復合物，是細胞由G1期進入S期所必需的[15]。而p16蛋白與CDKs競爭性結合cyclin D，并阻礙其與cyclin D形成激酶復合物，從而阻止細胞從G1期進入S期，細胞增殖受抑制。在本研究中，流式細胞術結果顯示，血根堿作用胃癌SGC-7901細胞24 h后，處于G1期胃癌細胞的比例明顯上升，S期的比例明顯下降，存在G1/S阻滯。蛋白免疫印跡結果顯示，與空白對照組相比，血根堿作用后cyclin D1、CDK4蛋白表達量明顯下調，而p16蛋白表達明顯上調。以上結果表明，不同濃度的血根堿通過調控cyclin D1、CDK4及p16的蛋白表達，阻滯細胞周期進展，最終抑制胃癌細胞增殖。

Fig 5 Effect of sanguinarine on expression levels of MMP-2, MMP-9, cyclin D1, CDK4 and

*P<0.05vscontrol

綜上所述，本研究表明血根堿在體外表現出較強抑制胃癌細胞生長的作用，其機制可能與阻滯胃癌細胞周期有關，同時血根堿還能通過抑制胃癌細胞的遷移達到抗癌目的，為血根堿用于治療胃癌的臨床研究提供了重要的理論依據。