白藜蘆醇誘導人乳腺癌MDA-MB231細胞凋亡及自噬

朱 濤，涂淑貞，楊陽麗，許禮發，劉群紅

(安徽理工大學醫學院前沿醫學中心，安徽 淮南 232001)

乳腺癌屬于全世界范圍內多發性的惡性腫瘤，每年新增約120萬女性患者，死亡50萬名患者。我國目前乳腺癌患者發病率和增速都很快，其原因可能與乳腺癌的高侵襲力和轉移有關，因此，如何抑制癌細胞增殖、降低侵襲轉移和促進凋亡是治療的基礎[1]。中藥由于具有多靶點、療效好、副作用小等優點，當前已廣泛用于腫瘤的臨床治療。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是葡萄、虎杖等植物中的多酚類化合物，具有抗氧化、免疫調節、抗腫瘤等藥理作用[2]。細胞凋亡是在基因嚴格調控下的逐漸死亡，真核生物細胞衰老、變性的細胞器需要通過自噬-溶酶體途徑降解，可抑制細胞內致突變物的聚集，減少基因突變，故凋亡和自噬可以穩定細胞內環境作用[3]。Res能否通過凋亡和自噬作用抑制乳腺癌MDA-MB231細胞增殖，目前尚未見文獻報道。本研究采用不同濃度Res體外作用于人乳腺癌MDA-MB231細胞，通過觀察Res抑制乳腺癌細胞的增殖和誘導凋亡作用，進一步探討Res抑制乳腺癌細胞增殖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人乳腺癌MDA-MB231細胞株，由中國上海細胞研究所提供。

1.1.2試劑 Res(分子式C14H12O3，CAS號：501-36-0，純度≥99%，美國Sigma公司)；DMEM高糖培養基、胎牛血清(FBS)，均購自美國HyClone公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒、二甲亞砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BAS)、β-巰基乙醇等試劑，均購自美國Amresco公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；一抗LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、Beclin-1、β-actin，均購自美國Cell Signal公司；BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發光液(美國Pierce公司)；其他試劑為國產分析純。

1.1.3儀器 酶聯免疫分析儀(美國BioTek公司)；激光共聚焦顯微系統(德國Leica公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；凝膠成像系統(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1MTT法測定Res對MDA-MB231細胞增殖的影響 對數生長期的MDA-MB231細胞(1.0×105·L-1)，按照每孔50 μL接種于96孔板培養24 h后，加入Res(終濃度0、1、5、10、20、50、100、200 mg·L-1)50 μL，每組設5個復孔。置37 ℃、飽和濕度、5% CO2孵育箱中培養48 h，每孔加入5 mg·L-1MTT溶液20 μL，培養4 h；棄培養基，加入DMSO中止反應，待結晶紫溶解后，酶標儀檢測各組MDA-MB231細胞在570 nm處的吸光度值(OD值)，計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率%=(1-給藥組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.2劃痕實驗測定細胞遷移能力 將濃度為1.0×106·L-1的MDA-MB231接種于6孔培養板中，常規培養48 h后，棄培養基，沿每孔中軸，微量吸液管槍頭在單層乳腺癌細胞表面劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min×3次，充分洗去細胞殘渣，加入含Res(終濃度0、5、20、60 mg·L-1)的DMEM培養基于6孔板中，再次置于37 ℃、5% CO2培養箱中，培養48 h，拍照，計算細胞劃痕愈合率，細胞劃痕愈合率=(初始劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 MDA-MB231細胞接種于6孔板(1.0×106個/孔)，Res(終濃度0、5、20、60 mg·L-1)作用24 h后，PBS洗滌2次，先后加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)雙標記染液，輕輕混勻，4 ℃避光孵育0.5 h，流式細胞儀檢測及結果分析。

1.2.4免疫熒光檢測LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白在MDA-MB231中的表達 MDA-MB231細胞接種于6孔板中(1.0×106個/孔)，培養24 h后，加入Res(終濃度0、5、20、60 mg·L-1)，按照試劑盒說明書，準備細胞爬片，常規培養48 h，去除培養基，4%丙酮固定0.5 h，PBS洗滌10 min×2次；0.1% Triton X-100透膜15 min，PBS洗滌10 min×2次；山羊血清封閉0.5 h，滴加抗LC3Ⅰ/Ⅱ抗體(1 ∶200)50 μL，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌；熒光標記二抗(1 ∶300)37 ℃避光處理1 h，抗熒光淬滅劑封固，激光共聚焦顯微鏡觀察、攝片。

1.2.5蛋白免疫印跡法檢測自噬相關蛋白p62、Beclin-1表達 1.0×106個MDA-MB231細胞接種到25 mL培養瓶中，加入5 mL DMEM培養液，培養24 h后，加入Res(終濃度0、20、60 mg·L-1)作用48 h，蛋白裂解液提取細胞總蛋白，蛋白濃度測定采用BCA法，取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗p62(1 ∶1 500)、Beclin-1(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜；次日洗膜后加入二抗，37 ℃孵育1 h，TBST液充分洗膜，ECL化學發光，顯影、定影。

2 結果

2.1 Res對MDA-MB231細胞增殖的影響Res作用MDA-MB231細胞48 h后，MTT法檢測表明，如Fig 1所示，與對照組(Res 0 mg·L-1)相比，Res抑制MDA-MB231細胞的增殖呈濃度依賴性(P<0.05)，其IC50值為49.2 mg·L-1。

Fig 1 Effect of Res on proliferation of breast cancer

*P<0.05, **P<0.01 vs Res (0 mg·L-1)

2.2 Res對MDA-MB231細胞遷移能力的影響如Fig 2所示，Res(0、5、20、60 mg·L-1)作用48 h后，與對照組比較，Res可抑制乳腺癌細胞的遷移能力，以對照組愈合率為100%計算，Res(5、20、60 mg·L-1)組乳腺癌細胞劃痕愈合率分別降低至(91.3±3.6)%、(83.5±4.6)%、(67.8±5.1)%。

2.3 Res上調MDA-MB231細胞的早期凋亡率Res(5、20、60 mg·L-1)處理MDA-MB231細胞24 h后，AnnexinV-FITC/PI雙染MDA-MB231細胞，檢測細胞早期凋亡率。如Fig 3所示，與對照組比較，Res組細胞早期凋亡率明顯增加(P<0.05，P<0.01)。

Fig 2 Effect of Res on 48 h migration

*P<0.05, **P<0.01 vs Res (0 mg·L-1)

2.4 Res上調MDA-MB231細胞中LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達激光共聚焦顯微鏡顯示(Fig 4)，對照組MDA-MB231細胞的胞質和胞核中LC3Ⅰ/Ⅱ綠色熒光強度較弱。Res(5、20、60 mg·L-1)作用MDA-MB231細胞后，MDA-MB231細胞的胞質和胞核中LC3Ⅰ/Ⅱ綠色熒光強度增強明顯，分布不均勻，以Res高濃度(60 mg·L-1)更為明顯。

2.5 Res對MDA-MB231細胞自噬相關蛋白p62、Beclin-1表達的影響Fig 5的Western blot結果表明，Res(20、60 mg·L-1)作用MDA-MB231細胞48 h后，與對照組比較，隨著Res濃度的升高，細胞中p62蛋白表達明顯降低，而Beclin-1蛋白表達明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

3 討論

乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤之一，且呈逐年上升趨勢，其發生、發展的分子機制目前尚不完全明確，科研人員也不斷研究和探索相關治療該腫瘤的新藥。天然多酚類化合物Res藥理學活性廣，有相關研究證實，Res具有抗腫瘤作用，可抑制肝癌、肺癌、膀胱癌等多種腫瘤細胞生長[4-6]。本研究利用MTT法，檢測Res對人乳腺癌MDA-MB231細胞生長的影響，結果表明，Res對乳腺癌細胞有增殖抑制作用，且抑制作用與Res濃度呈正相關。

Fig 3 Effect of different concentrations of Res on early apoptosis in MDA-MB231

Fig 4 Expression of LC3Ⅰ/Ⅱ of Res-treated MDA-MB231

A:Res (0 mg·L-1) ；B:Res (5 mg·L-1) ；C:Res (20 mg·L-1) ；D:Res (60 mg·L-1)

Fig 5 Effect of Res on p62 and Beclin-1 protein expressions

*P<0.05,**P<0.01vsRes (0 mg·L-1)

腫瘤細胞凋亡是化療藥物作用的重要機制，細胞早期凋亡狀態下，細胞膜呈不對稱性丟失，其明顯特點是細胞膜表面出現磷脂酰絲氨酸(PS)，暴露于凋亡細胞膜外，而Annexin V是檢測PS的敏感探針，通過流式細胞儀，應用Annexin-Ⅴ聯合PI可定量標記凋亡細胞[7]。選擇利用碘化丙啶(PI)，則可以區分Annexin V染色后的凋亡細胞和壞死細胞。本研究采用Annexin-Ⅴ/PI雙染技術進行檢測，結果表明，Res作用乳腺癌MDA-MB231細胞24 h后，乳腺癌細胞早期凋亡比例明顯升高，且隨著Res濃度的增加而增多，提示Res抑制人乳腺癌細胞增殖的機制可能與誘導其凋亡有關。

自噬是一種新的細胞降解途徑，為保守的細胞自我降解，溶酶體吞噬自身胞質或細胞器，從而再利用細胞內營養和能量，近年來被廣泛關注。在機體發育和抗老化等生理過程中，必需維持基礎水平的自噬。機體氧化應激、內環境穩態失調、缺乏營養等改變，會引起細胞自噬發生，進行機體細胞的自我保護，將待降解受損細胞器或胞質包裝形成自噬體，再與溶酶體融合和降解；當外界環境惡化沒有改善，細胞將啟動程序性死亡過程。在惡性腫瘤的發生、發展演變中，腫瘤細胞常出現自噬功能失調，在機體抗腫瘤治療中，細胞DNA損害、染色體穩定性降低均與自噬有關，控制腫瘤細胞的自噬過程有可能成為改善腫瘤治療，增加化療藥物的耐藥[8-10]。微管相關蛋白輕鏈3(LC3Ⅰ/Ⅱ)是自噬活性標志物，可反映自噬活性[9]。本研究激光共聚焦顯微鏡觀察發現，與對照組比較，Res作用MDA-MB231細胞后，在癌細胞的細胞質、細胞核中LC3Ⅰ/Ⅱ綠色熒光強度分布明顯增強，且高濃度Res作用的乳腺癌細胞中，LC3Ⅰ/Ⅱ綠色熒光強度更為明顯，表明Res處理有促進乳腺癌細胞自噬作用。Beclin-1和p62均是細胞內重要的自噬標記蛋白，相關研究表明[10]，Beclin-1基因敲除的小鼠較野生型小鼠體內易出現細胞器和蛋白質的異常積聚，形成惡性腫瘤。p62失活會減弱自噬，細胞核DNA更易出現損害而形成腫瘤。在本研究中，Western blot結果表明，與對照組比較，Res可上調MDA-MB231細胞中Beclin-1蛋白表達，而降低p62蛋白表達。提示Res作用后，乳腺癌細胞自噬相關蛋白Beclin-1、p62蛋白表達發生了改變。

綜上分析，本研究證實Res可抑制人乳腺癌MDA-MB231細胞增殖，促進其凋亡，引起LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、p62等自噬相關蛋白的表達改變，提示自噬有可能參與Res抑制乳腺癌細胞增殖過程中，但具體作用方式，與乳腺癌激素受體關系以及自噬是否為引發細胞凋亡的直接因素等，仍需進一步深入研究與探索。

(致謝：本實驗在安徽理工大學醫學院前沿醫學中心實驗室完成，在此感謝安徽理工大學醫學免疫教研室吳靜副教授、蔡茹教授對本實驗的支持和幫助。)