基于Cleaved caspase-9研究丹酚酸B對(duì)肝纖維化細(xì)胞凋亡的影響

闞 悅,楊 雁

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230023)

肝纖維化是肝臟組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)異常增生和過度沉積的病理性變化[1]，是所有慢性肝病的必經(jīng)過程[2]。目前認(rèn)為，肝纖維化是可逆的，而肝硬化、肝癌不可逆。因此，防治肝纖維化具有重要意義。抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells， HSCs)的活化、促進(jìn)其凋亡是目前抗纖維化的主要研究策略。線粒體通路是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一，激活的caspase-9即cleaved caspase-9是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白[3]，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，升高cleaved caspase-9的蛋白表達(dá)水平可觸發(fā)細(xì)胞凋亡[4]。

丹參是治療肝纖維化的傳統(tǒng)中藥，近年來其水溶性有效成分丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)在慢性肝病治療中得到了廣泛應(yīng)用[5]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，Sal B具有延緩二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化-肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)進(jìn)程的作用[6]。體外實(shí)驗(yàn)表明，Sal B可抑制HSC中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)表達(dá)及其激酶的活性，來抑制體外培養(yǎng)的原代大鼠HSC增殖[7],抑制內(nèi)源性TGF-β1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)肝纖維化[8]。

目前，Sal B對(duì)體內(nèi)外HSC的抑制活化[9]及增殖作用均有報(bào)道，其抗纖維化、延緩HCC進(jìn)程與調(diào)控TGF-β1/Smad通路、p-Smad3C/3L有關(guān)[6]。然而，從細(xì)胞凋亡角度觀察Sal B對(duì)外源性TGF-β1刺激的HSC-T6(來源于大鼠的活化的HSCs)的影響及其對(duì)凋亡蛋白cleaved caspase-9的影響，尚未見報(bào)道。我們推測(cè)，Sal B抗肝纖維化作用可能與促進(jìn)體內(nèi)、體外HSCs凋亡，調(diào)控cleaved caspase-9有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用DEN誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型,并結(jié)合體外培養(yǎng)HSC-T6，從細(xì)胞凋亡角度探討Sal B對(duì)體內(nèi)外肝纖維化細(xì)胞的影響，并探究Sal B對(duì)凋亡蛋白cleaved caspase-9的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 Sal B(純度≧95%，批號(hào)：PS12091001)、秋水仙堿(colchicine，Col)(純度≧98%，批號(hào)：PS08092201)，購于成都普思生物科技有限公司；DEN(0.95 kg·L-1)購于美國Sigma公司；TGF-β1，購于Peprotech公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、Hoechst 33258熒光染液、Western及IP細(xì)胞裂解液、兔抗Cleaved caspase-9單克隆抗體，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;小鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG，均購自北京中杉金橋。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株 50只健康♂昆明系小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：sexk(皖)2011-002。大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3儀器 JA1003電子天平(上海精科儀器有限公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus 公司)；LEICA RM2035型生物組織切片機(jī)(湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；Napco-6100型CO2培養(yǎng)箱(美國杜邦公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1肝纖維化模型的制備及Sal B干預(yù) 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，將50只小鼠隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、Sal B低、高劑量(15、30 mg·kg-1)組、陽性藥秋水仙堿(0.2 mg·kg-1)組,每組10只。正常組小鼠注射無菌的生理鹽水，其余4組注射1.0% DEN溶液來誘導(dǎo)肝纖維化模型，每組按照體質(zhì)量10 mL·kg-1腹腔注射給藥，同一時(shí)間每周1次，共12周。在此基礎(chǔ)上，Sal B低、高劑量組及陽性藥秋水仙堿組于造模當(dāng)天開始灌胃，正常組小鼠給予相應(yīng)溶媒灌胃，每天同一時(shí)間段給藥至12周末。于12周末處死小鼠，取材，按照步驟進(jìn)行組織的固定、病理檢測(cè)以及蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.2.2HSC-T6細(xì)胞株的培養(yǎng)、分組及TGF-β1干預(yù) HSC-T6培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。每2～3 d傳代，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)消化，6孔板中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。實(shí)驗(yàn)分為6組：對(duì)照組、TGF-β1組、Sal B組(Sal B 25、50、100 μmol·L-1+TGF-β1)、Sal B對(duì)照組(Sal B 50 μmol·L-1)。待6孔板內(nèi)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，將培養(yǎng)基更換為無血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,避光環(huán)境下配制低、中、高濃度Sal B溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，于Sal B組和Sal B對(duì)照組加入相應(yīng)濃度的Sal B，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,終止培養(yǎng)前6 h，于TGF-β1組和Sal B組加入TGF-β1(9 pmol·L-1)。

1.2.3HE染色法評(píng)估病理學(xué)特征并確定纖維化病變區(qū)域 小鼠腹部正中切口，無菌條件下打開腹腔，摘除整個(gè)肝臟，選取小鼠肝臟左葉，采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)步驟進(jìn)行梯度乙醇脫水，浸蠟，石蠟包埋,4 μm切片，烤片，脫蠟，蘇木精-伊紅(HE)染色。常規(guī)步驟脫水，透明，干燥，中性樹膠封固。按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，使用數(shù)字掃描儀顯微鏡，每組隨機(jī)拍攝圖片10張，請(qǐng)病理老師閱片，確定纖維化病變程度。

1.2.4Hoechst 33258熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 切片梯度乙醇脫蠟后，用PBS或0.9% NaCl洗2遍，每次3 min，吸盡切片上的液體后，于玻片側(cè)邊輕輕滴加0.5 mL Hoechst 33258染色液，傾斜玻片，讓染色液慢慢浸過組織切片表面，避光均勻染色5 min，PBS清洗2遍去除染色液。染色后吸盡表面液體，滴加抗熒光猝滅液于組織切片上，鑷子夾取潔凈蓋玻片蓋上，避光環(huán)境下，在熒光顯微鏡下觀察和拍攝圖片，每個(gè)樣本隨機(jī)拍攝10張，保持曝光度和對(duì)比度一致。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞凋亡率 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞均勻種于6孔板內(nèi)，更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基，Sal B組分別加入濃度為25、50、100 μmol·L-1的Sal B，Sal B對(duì)照組加50 μmol·L-1的Sal B，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h,終止培養(yǎng)前6 h，于Sal B組和TGF-β1組加TGF-β1進(jìn)行干預(yù)。用不含EDTA的胰酶消化離心后，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×109·L-1,冷PBS洗滌細(xì)胞2次后，分別加入400 μL Annexin V結(jié)合液和5 μL Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后，于2～8 ℃孵育15 min，加入5 μL PI染色液混勻后，于2～8 ℃孵育5 min。染色完成后用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，采用Flowjo軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Western blot法檢測(cè)小鼠肝組織和HSC-T6中cleaved caspase-9蛋白的表達(dá) 常規(guī)方法分別提取小鼠肝組織和HSC-T6細(xì)胞中的蛋白，采用BCA法定量樣本蛋白濃度，PBS緩沖液調(diào)整各樣本蛋白提取液至同一濃度水平。常規(guī)步驟進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉，分別以抗β-actin、cleaved caspase-9抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，繼而以相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)IgG常溫孵育120 min，TBST洗膜3次,每次10 min,ECL法曝光顯影。采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin條帶的灰度值比值表示。

2 結(jié)果

2.1 Sal B對(duì)DEN誘導(dǎo)的纖維化小鼠肝組織病理學(xué)的影響Fig 1的HE染色結(jié)果顯示，12周時(shí)正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，有肝小葉和匯管區(qū)、肝細(xì)胞的細(xì)胞核呈圓形，著色較淺，位于細(xì)胞中央。與正常組比較，模型組纖維化程度明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞大小不一，能清楚地觀察到肝小葉被分隔成假小葉，提示DEN誘導(dǎo)小鼠12周為肝纖維化時(shí)期。Sal B低、高劑量組纖維化程度均輕于模型組，且未形成假小葉結(jié)構(gòu)。HE染色結(jié)果提示，Sal B能夠改善DEN誘導(dǎo)的肝纖維化期小鼠肝組織病理學(xué)變化，并確定纖維化病變區(qū)域。

2.2 Sal B對(duì)DEN誘導(dǎo)的纖維化小鼠肝組織中細(xì)胞凋亡的影響在HE染色確定纖維化病變區(qū)域的基礎(chǔ)上，采用Hoechst 33258熒光染色法對(duì)同一區(qū)域進(jìn)行染色。如Fig 2所示，低倍鏡下，正常組呈現(xiàn)彌散均勻的藍(lán)色熒光，模型組呈現(xiàn)較淺的絮狀藍(lán)色；與模型組相比，Sal B低、高劑量組在纖維化病變區(qū)域呈現(xiàn)明顯的藍(lán)白色熒光。高倍鏡下，正常組肝細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，呈現(xiàn)彌散均勻的藍(lán)色，致密濃染的顆粒狀熒光為凋亡細(xì)胞核，凋亡細(xì)胞均勻分布在組織中；模型組高倍鏡下呈現(xiàn)淺藍(lán)色，大量細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，失去正常形態(tài)，僅發(fā)現(xiàn)少量熒光碎片；與模型組相比，Sal B低、高劑量組在纖維化區(qū)域呈現(xiàn)大面積的致密濃染的熒光，其中高劑量組高倍鏡下熒光強(qiáng)度最大，提示Sal B能夠有效促進(jìn)纖維化區(qū)域的細(xì)胞凋亡，尤以高劑量最佳。

2.3 Sal B對(duì)DEN誘導(dǎo)的纖維化小鼠肝組織中cleaved caspase-9蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，與正常組相比，模型組小鼠肝組織中cleaved caspase-9蛋白表達(dá)量降低；與模型組比較，Sal B低、高劑量組cleaved caspase-9表達(dá)明顯升高。提示Sal B能夠明顯升高肝纖維化組織中cleaved caspase-9的表達(dá)水平。

2.4 Sal B對(duì)TGF-β1刺激的HSC-T6凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 4)，TGF-β1組與對(duì)照組相比，凋亡率明顯下降(P<0.01)，提示TGF-β1抑制HSC-T6的凋亡。Sal B藥物對(duì)照組與對(duì)照組相比，凋亡率上升，提示Sal B有促凋亡的作用(P<0.01)。Sal B組(TGF-β1+Sal B 25、50、100 μmol·L-1)與TGF-β1組相比，凋亡率上升，且呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.01)，提示Sal B對(duì)經(jīng)TGF-β1刺激的HSC-T6仍有促進(jìn)凋亡的作用。

Fig 1 Effect of Sal B on hepatic fibrosis in DEN induced mice(HE,×100)

Fig 2 Effect of Sal B on apoptosis of liver tissues in DEN induced fibrotic mice(Hoechst 33258 staining)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsModel

2.5SalB對(duì)TGF-β1刺激的HSC-T6中cleavedcaspase-9蛋白表達(dá)的影響Fig 5的Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1組cleaved caspase-9蛋白表達(dá)量降低(P<0.01)，藥物對(duì)照組(Sal B 50 μmol·L-1)的凋亡率上升(P<0.01)，提示TGF-β1降低cleaved caspase-9的表達(dá)，Sal B升高cleaved caspase-9表達(dá)水平；與TGF-β1組相比，Sal B組(TGF-β1+Sal B 50 μmol·L-1)cleaved caspase-9蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，提示Sal B能夠升高TGF-β1刺激的HSC-T6中cleaved caspase-9的表達(dá)水平。

Fig 5 Effect of Sal B on expression of cleaved-caspase-9 in HSC-T6 cells stimulated by

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsTGF-β1;▲▲P<0.01vsSal B 50 μmol·L-1

3 討論

肝纖維化是肝硬化、肝癌等肝病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前已有大量肝纖維化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肝纖維化是一種可逆的瘢痕修復(fù)反應(yīng)，在其形成過程中進(jìn)行適當(dāng)干預(yù)可阻斷，甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化[10]。本實(shí)驗(yàn)采用DEN腹腔注射給藥誘導(dǎo)肝纖維化模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12周末小鼠肝臟切片模型組HE染色能夠發(fā)現(xiàn)明顯的假小葉結(jié)構(gòu)，具備肝纖維化的基本特征，提示DEN誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型制備成功。

肝纖維化主要由于ECM過度沉積所致，而活化的HSC是ECM的主要來源，HSC活化為成纖維樣細(xì)胞是公認(rèn)的肝纖維化進(jìn)展中的重要環(huán)節(jié)[11]，因而通過促進(jìn)活化的HSC凋亡是目前研究抗纖維化的熱點(diǎn)，但是在組織中我們無法直接辨認(rèn)出凋亡的是否是HSC。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HE染色來確定纖維化的病變區(qū)域，在同一區(qū)域采用Hoechst 33258進(jìn)行熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，Sal B低、高劑量組與模型組相比，纖維化病變區(qū)域呈致密濃染的顆粒狀熒光明顯增多，即凋亡的纖維化細(xì)胞明顯增多，提示Sal B促進(jìn)纖維化肝組織中活化的HSC細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)采用HE、Hoechst 33258兩種染色方式，在體內(nèi)的細(xì)胞水平上提示了Sal B促進(jìn)HSC的凋亡，為進(jìn)一步探究Sal B可能的促凋亡機(jī)制，采用體外培養(yǎng)活化的肝纖維化細(xì)胞HSC-T6，Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)凋亡率。結(jié)果提示，TGF-β1可明顯抑制HSC-T6凋亡，Sal B可促進(jìn)經(jīng)TGF-β1刺激的HSC-T6的凋亡，且隨著藥物濃度的增加，凋亡率也隨之增加。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示，Sal B能夠明顯促進(jìn)體內(nèi)外HSC凋亡。

細(xì)胞凋亡關(guān)聯(lián)到一系列調(diào)控因子，主要受細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的調(diào)控，pro-caspase-9是線粒體通路的啟動(dòng)者，線粒體釋放細(xì)胞色素C后，pro-caspase-9可以與細(xì)胞色素C及信號(hào)接頭分子Apaf-1結(jié)合并形成復(fù)合物，同時(shí)自身被剪切為cleaved caspase-9，cleaved caspase-9進(jìn)一步激活下游的凋亡執(zhí)行者caspase-3，進(jìn)行一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11-12]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Sal B對(duì)小鼠肝纖維化組織及HSC-T6細(xì)胞中cleaved caspase-9蛋白表達(dá)的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，Sal B低、高劑量組均能夠明顯上調(diào)cleaved caspase-9的表達(dá)；體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β1能夠下調(diào)cleaved caspase-9蛋白表達(dá)，Sal B組(TGF-β1+Sal B 50 μmol·L-1)可明顯上調(diào)cleaved caspase-9的表達(dá)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均提示Sal B促肝纖維化細(xì)胞凋亡與上調(diào)cleaved caspase-9表達(dá)相關(guān)。

綜上，Sal B能夠有效促進(jìn)體內(nèi)外HSCs的凋亡，其促凋亡機(jī)制可能與上調(diào)cleaved caspase-9蛋白表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步明確Sal B抗肝纖維化的機(jī)制研究提供了依據(jù)，為臨床治療提供幫助。