白藜蘆醇通過促進(jìn)線粒體自噬減輕小鼠腦缺血/再灌注損傷的實(shí)驗研究

向 菲，李明航，徐 露，田曉翠，劉海林，劉道航，董 志

(1. 重慶市生物化學(xué)與分子藥理重點(diǎn)實(shí)驗室，2. 重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶 400016；3. 重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)院，重慶 401331)

中風(fēng)的年發(fā)病率和死亡率在過去的30年間逐年上升，其中缺血性腦中風(fēng)占有很大比例[1]。當(dāng)積極采取措施恢復(fù)缺血腦組織血供時，反而對機(jī)體造成二次打擊的現(xiàn)象被稱之為腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。這是一個涉及多種機(jī)制的復(fù)雜的病理生理過程。其中血液的復(fù)灌使得細(xì)胞大量產(chǎn)生遠(yuǎn)超于其所能負(fù)荷的氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，線粒體作為自由基的主要來源之一和首要攻擊對象，受損嚴(yán)重。功能失常的線粒體不僅不能持續(xù)有效地為大腦供能，還會釋放大量促凋亡因子，激發(fā)線粒體凋亡通路[2]。可見，確保線粒體健康對減輕I/R損傷的重要性。

線粒體自噬是一個特異性靶向受損線粒體，并將其降解掉的過程，通過對受損線粒體的及時清除，它可以有效阻斷受損線粒體引發(fā)的細(xì)胞死亡[3]。此外，自噬所生成的氨基酸、脂肪酸等小分子化合物可以被機(jī)體回收利用，重新參與到細(xì)胞的物質(zhì)代謝中。因此，調(diào)控線粒體自噬對I/R損傷的治療具有重要意義。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種多酚類化合物，廣泛存在于葡萄、花生等天然植物中。其所具備的多重藥理作用得益于對沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)的激活[4]。SIRT1最早被人熟知是它的抗衰老作用，近年來幾種有前景的腦缺血治療方法，如缺血預(yù)處理、熱量限制，以及其他化合物的使用均涉及對其的調(diào)控[5]。因此，SIRT1成為了減輕I/R損傷的重要靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在Res眾多神經(jīng)保護(hù)機(jī)制中，SIRT1對線粒體結(jié)構(gòu)功能，以及線粒體相關(guān)通路發(fā)揮著重要調(diào)控作用[6]。但其分子機(jī)制還不十分清楚。故本實(shí)驗擬利用線栓法建立小鼠I/R損傷模型，觀察Res對I/R損傷的保護(hù)作用，及其可能涉及的對線粒體自噬的調(diào)控，為中風(fēng)病人的線粒體靶向治療提供新的思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗動物C57BL/6J ♂小鼠96只，體質(zhì)量(22～25) g，SPF級，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，許可證號：SCXK渝2012-0001。

1.2 試劑Res(R5010)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride solution，TTC)(17779)均購自Sigma公司；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)(S2767)，購自Selleck公司；組織線粒體分離試劑盒(C3606)、增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒(S0026)、線粒體膜電位檢測試劑盒(C2006)、蛋白印跡相關(guān)試劑，均購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體SIRT1(8469S)、細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC)(4272S)、p62(5114S)、微管相關(guān)蛋白3B(microtubule-associated protein light chain 3B，LC3B)(3868S)、抑制素2(prohibitin 2，PHB2)(14085S)，均購自CST公司；抗體外膜移位酶20(translocase of outer membrane 20，TOM20)(11802-1-AP)、β-actin(60008-1-lg)、環(huán)氧酶Ⅳ(cycloxygenaseⅣ，COXⅣ)(11242-1-AP)，均購于Proteintech公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器立體定位儀(瑞沃德公司)；微量進(jìn)樣針(寧波三愛儀器廠)；-80 ℃超低溫冰箱、低溫離心機(jī)(Thermo公司)；濕式轉(zhuǎn)膜儀、垂直電泳槽(六一儀器廠)；酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)；透射電鏡(Hitachi公司)。

2 方法

2.1 大鼠腦I/R模型的建立及給藥方案采用線栓法建立小鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，將其仰臥固定，常規(guī)消毒，取頸部正中縱切口，逐層分離組織，分別用自制小拉鉤拉向兩旁進(jìn)行固定。在顯微鏡下分離出右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎ECA，動脈夾暫時夾畢CCA和ICA。在ECA結(jié)扎處遠(yuǎn)心端剪一斜口，經(jīng)此斜口插入頂端硅膠包被的直徑0.18 mm的線栓，經(jīng)ICA進(jìn)入大腦前動脈(anterior cerebral artery，ACA)的起始部，遇輕微阻力即停止。栓塞1 h后，拔出線栓，再灌注24 h，模擬急性腦梗死模型。假手術(shù)組除不插栓外，其余步驟同模型組。

2.2 分組與給藥將小鼠隨機(jī)分成4組：假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血/再灌注模型組(I/R組)、Res處理組(Res組)、Res處理加3-MA抑制劑組(Res+3-MA組)。Res用體積分?jǐn)?shù)為0.50的乙醇溶解，再用生理鹽水稀釋配制。小鼠在用藥前稱重，分別腹腔注射給予Res(30 mg·kg-1)，每天1次，d 5術(shù)前30 min再給藥1次。I/R組予以溶劑處理。Res+3-MA組小鼠于拔栓時用微量注射器向右側(cè)腦室(前囟點(diǎn)旁開1 mm，右側(cè)冠狀縫后0.3 mm，腔深3 mm)給予7.5 μg 3-MA[3]。在造模過程中用白熾燈加熱，維持肛溫37 ℃左右。

2.3 TTC染色檢測腦梗死體積術(shù)后24 h，小鼠麻醉后，立即取腦，置于-20 ℃中冰凍。待組織凍硬后，在冰上將大腦由前向后做冠狀切片。放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的TTC染液中，37 ℃避光染色20 min，隔10 min翻動1次。紅色為正常組織，白色為梗死灶。染色完成后，于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛中固定，4 ℃過夜后拍照。為排除梗死側(cè)大腦水腫對計算的影響，采用公式：(對側(cè)半球體積-同側(cè)半球正常腦組織體積)/對側(cè)半球體積×100%，計算損傷側(cè)腦梗死體積。

2.4 神經(jīng)功能評分缺血/再灌注24 h后，參照改良的Longa評分[7]對小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評分。0分：無明顯神經(jīng)功能缺損；1分：提尾時，對側(cè)前肢不能前伸；2分：向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：不能承受對側(cè)自身重量；4分：無自主運(yùn)動或意識障礙。分值越高，說明動物行為障礙越嚴(yán)重。

2.5 線粒體和胞質(zhì)的分離參照組織線粒體分離試劑盒說明書，取新鮮腦組織，稱重，剪碎，按照50 mg組織加入500 μL預(yù)冷的線粒體分離試劑A的比例加入分離試劑A，勻漿10次左右。收集勻漿液，于600×g，4 ℃離心10 min，收集上清于11 000×g，4 ℃離心10 min，沉淀即為線粒體。余下上清液于12 000×g，4 ℃離心10 min，所獲得上清即為細(xì)胞質(zhì)蛋白。所有操作均在4 ℃進(jìn)行。

2.6 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)檢測先使用組織線粒體分離試劑盒快速獲取線粒體，參照線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)使用說明書，取0.9 mL稀釋好的JC-1染色工作液，加入0.1 mL總蛋白量約為50 μg純化線粒體。混勻后，使用流式細(xì)胞儀分析各組紅綠熒光轉(zhuǎn)變。

2.7 線粒體檢測ATP水平參照增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒說明書，按每20 mg組織加入約120 μL裂解液的比例加入裂解液，在4 ℃條件下，用玻璃勻漿器勻碎。所得裂解液于12 000×g，4 ℃離心5 min，收集上清待測。另外用ATP檢測裂解液將ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻取?6孔板中每孔加入100 μL ATP檢測工作液，室溫放置3～5 min，待本底ATP耗完后，再往孔內(nèi)加入20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，最后使用具有檢測化學(xué)發(fā)光的多功能酶標(biāo)儀讀取相對光單位值。為了消除誤差，把ATP的濃度換算成mmol·g-1蛋白的形式。

2.8 透射電鏡檢測線粒體超微結(jié)構(gòu)缺血/再灌注24 h后，深度麻醉麻醉小鼠，用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定液經(jīng)心臟灌流固定腦組織，完畢后快速取腦。于冰上用雙面刀片切取損傷側(cè)海馬1 mm3大小的組織塊，置于盛有預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)4%的戊二醛中，送至重慶醫(yī)科大學(xué)生科院電鏡室做后續(xù)處理，并采集圖片。

2.9 Western blot法檢測蛋白的表達(dá)收集各組腦組織，使用RIPA蛋白裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)裂解腦組織總蛋白、線粒體和胞質(zhì)蛋白，并用BCA法測蛋白濃度。取40 μg蛋白，進(jìn)行聚丙烯胺凝膠電泳分離蛋白，再以濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜。次日再加二抗孵育1 h，最后顯影成像，Image Lab軟件(Bio-Rad)對Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1 3-MA阻斷Res對小鼠I/R損傷的保護(hù)作用TTC染色和Longa評分結(jié)果顯示，與模型組相比，Res預(yù)處理可以明顯減少I/R小鼠損傷側(cè)梗死體積(Fig 1A、1B)，降低神經(jīng)行為學(xué)評分分值(Fig 1C)。當(dāng)對Res預(yù)處理組給予3-MA干預(yù)后，小鼠腦梗死體積和神經(jīng)行為學(xué)評分與Res預(yù)處理組相比均增加。結(jié)果表明，Res可以減輕小鼠腦I/R損傷，且這一過程中自噬發(fā)揮著積極作用。

Fig 1 3-MA blocked neuroprotective effects of Res in I/R injured brains

3.2 3-MA抑制Res對小鼠I/R腦組織SIRT1水平的上調(diào)Fig 2的Western blot結(jié)果顯示，與模型組相比，Res預(yù)處理組中，SIRT1表達(dá)增多。當(dāng)對Res預(yù)處理組給予3-MA干預(yù)后，SIRT1表達(dá)減少。說明Res在發(fā)揮腦保護(hù)作用過程中，與其對SIRT1的調(diào)控有關(guān)。

Fig 2 3-MA inhibited Res-induced expression of SIRT1 in I/R injured

*P<0.05vsI/R;##P<0.01vsI/R+Res

3.3 3-MA抑制Res對小鼠I/R腦組織線粒體自噬水平的上調(diào)Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，與模型組相比，Res預(yù)處理組中，p62表達(dá)減少，LC3B-Ⅱ表達(dá)增多，蛋白PHB2和TOM20的表達(dá)均減少。當(dāng)對Res預(yù)處理組給予3-MA干預(yù)后，p62表達(dá)增多，LC3B-Ⅱ表達(dá)減少，PHB2和TOM20表達(dá)明顯增多。說明Res所發(fā)揮的腦保護(hù)作用與促進(jìn)線粒體自噬有密切關(guān)系。

3.4 Res減少I/R小鼠腦組織中線粒體CytC釋放的作用被3-MA抑制Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，與模型組相比，Res預(yù)處理明顯降低了線粒體中CytC的釋放量。當(dāng)對Res預(yù)處理組給予3-MA抑制自噬后，胞質(zhì)中的CytC明顯增多。說明Res誘導(dǎo)的自噬激活可以減少線粒體中促凋亡蛋白的釋放。

3.5 Res對I/R小鼠腦組織中線粒體相關(guān)功能指標(biāo)的保護(hù)作用被3-MA阻斷MMP和ATP檢測結(jié)果顯示，與模型組相比，Res預(yù)處理明顯提高了MMP(Fig 5A、5B)，改善了線粒體ATP合成能力(Fig 5C)。當(dāng)對Res預(yù)處理組給予3-MA抑制自噬后，MMP降低，線粒體ATP合成能力受損。結(jié)果表明，Res調(diào)控的線粒體自噬可以減輕I/R導(dǎo)致的線粒體損傷。

Fig 3 3-MA prevented Res-induced mitophagy

*P<0.05,**P<0.01vsI/R;#P<0.05,##P<0.01vsI/R+Res

Fig 4 3-MA redistributed location of CytC

**P<0.01vsI/R;##P<0.01vsI/R+Res

Fig 5 3-MA blocked mitochondrial protection of Res in I/R injured

A: Flow cytometry analysis of JC-1 to measure mitochondrial membrane potential; B: The quantitative diagram of A diagram; C: Luminescence of the cellular ATP levels were detected using a microplate reader.**P<0.01vsI/R;#P<0.05,##P<0.01vsI/R+Res.

3.6 Res對小鼠I/R腦組織線粒體超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用被3-MA阻斷Fig 6的透射電鏡檢測結(jié)果顯示，模型組中，線粒體明顯腫脹，內(nèi)部嵴破壞或消失，且呈現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)。在Res預(yù)處理組中，線粒體損傷情況明顯得到改善，且紅色箭頭處可見線粒體中受損部分與健康部分正發(fā)生裂解，提示有發(fā)生自噬的可能[8]。對Res預(yù)處理組給予3-MA，抑制自噬后，線粒體結(jié)構(gòu)明顯受損。說明Res在減輕腦損傷的作用中，其所調(diào)控的線粒體自噬的重要性。

4 討論

Res具有廣泛藥理活性[9]，近年來其受到許多學(xué)者的關(guān)注。在本研究中發(fā)現(xiàn)，Res可以減少小鼠腦組織I/R損傷后的梗死體積，降低神經(jīng)行為學(xué)評分。并且該實(shí)驗還觀察到Res可以減少I/R損傷導(dǎo)致的線粒體中CytC釋放，提高線粒體MMP和ATP水平，因此Res的神經(jīng)保護(hù)作用與其保障線粒體功能有關(guān)。但是當(dāng)在原有的Res預(yù)處理的基礎(chǔ)上，另外再給予自噬抑制劑3-MA后，Res的神經(jīng)保護(hù)作用受到了抑制，而且以上所提及線粒體功能相關(guān)指標(biāo)結(jié)果也顯示，Res對線粒體的保護(hù)作用遭到了破壞，說明Res對線粒體結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)有線粒體自噬的參與。

Fig 6 Changes of mitochondrial ultrastructure investigated by electron microscopy(scale bar:500 nm)

Black arrows show healthy mitochondria. Red arrows show destroyed mitochondria.

Res的藥理活性與SIRT1密切相關(guān)。SIRT1作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的蛋白去乙酰化酶，可以調(diào)控多種組蛋白以及非組蛋白的去乙酰化水平，從而進(jìn)一步調(diào)控凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥的發(fā)生[10]。有文獻(xiàn)報道，SIRT1還可以乙酰化Atg5、Atg7、Atg8以及LC3等自噬相關(guān)蛋白，從而促進(jìn)自噬發(fā)生[11-12]。線粒體自噬作為選擇性自噬的一種，同樣也會受到這些蛋白的調(diào)控。p62、LC3B-Ⅱ在自噬/線粒體自噬中，分別發(fā)揮著標(biāo)記并聚集受損蛋白、線粒體，以及形成自噬小體的作用，均在自噬過程中占據(jù)重要地位。因此，本研究選取p62、LC3B-Ⅱ為自噬/線粒體自噬發(fā)生的標(biāo)志性蛋白。此外，佐證線粒體自噬的發(fā)生還需要檢測線粒體相關(guān)蛋白的變化。其中，分布于線粒體外膜上的蛋白TOM20可反映出線粒體含量變化，而分布于線粒體內(nèi)膜上的蛋白PHB2因其結(jié)構(gòu)里具有的LC3結(jié)合域[13]，有助于受損的線粒體被自噬小體錨定并最終降解，是近來被證實(shí)的線粒體自噬標(biāo)記物。本實(shí)驗研究結(jié)果顯示，Res可以激活SIRT1，提高LC3B-Ⅱ，降低p62、PHB2、TOM20蛋白表達(dá)，當(dāng)在Res預(yù)處理的基礎(chǔ)上額外給予3-MA時，Res所引起的這些蛋白變化均被翻轉(zhuǎn)。因此，進(jìn)一步說明Res在減輕小鼠I/R損傷中促進(jìn)了線粒體自噬發(fā)生，而且這個過程可能受到SIRT1的調(diào)控。

面對再灌注所造成的大量功能失常線粒體的堆積，線粒體自噬的參與尤為重要。它們的激活一是有效地防止損傷進(jìn)一步擴(kuò)大，二是為線粒體更新提供物質(zhì)基礎(chǔ)，以保證大腦的能量供應(yīng)。由此可見，線粒體自噬在I/R損傷中的重要意義。但是線粒體自噬同自噬一樣，均存在著許多爭議。有學(xué)者認(rèn)為，在缺血性腦中風(fēng)中，血液復(fù)灌會導(dǎo)致自噬/線粒體自噬過度激活，使其從保護(hù)性角色轉(zhuǎn)換成了破壞性角色。因此，抑制自噬/線粒體自噬可以減輕I/R損傷[14]。也有學(xué)者持不同的觀點(diǎn)，認(rèn)為在復(fù)灌中適當(dāng)促進(jìn)線粒體自噬，選擇性地降解受損線粒體，對神經(jīng)細(xì)胞存活十分有益[15]。總之，不必要或是不充分的降解線粒體才是自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡的原因。所以在未來的研究中，更應(yīng)該關(guān)注針對不同疾病及其不同階段中，對自噬發(fā)生強(qiáng)弱的控制上。

在本實(shí)驗中，我們發(fā)現(xiàn)Res引起的線粒體自噬減輕了線粒體損傷，最終起到了腦保護(hù)作用。在對于線粒體穩(wěn)態(tài)的調(diào)控中，線粒體自噬只屬于其中的一環(huán)，其中還涉及到線體粒生物合成、線粒體裂解與融合相關(guān)機(jī)制的調(diào)控[8]。有文獻(xiàn)報道，Res激動SIRT1后，可進(jìn)一步調(diào)控過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α，從而促進(jìn)線粒體生物合成[2]，起到平衡線粒體自噬的作用。此外，線粒體是一種處于動態(tài)變化的細(xì)胞器，其在裂解與融合這兩個對立過程中維持著線粒體形狀、大小、數(shù)量以及生理功能。其中，在線粒體裂解的協(xié)助下，線粒體中受損部分發(fā)生選擇性自噬，而剩余的健康部分則在線粒體融合的調(diào)控下重新組裝一個新的線粒體。因此，線粒體在這4部分的共同協(xié)調(diào)下維持著正常水平。本實(shí)驗在電鏡下觀察到，Res處理組中有線粒體正處于裂解狀態(tài)，提示進(jìn)一步線粒體自噬的可能發(fā)生。可見，Res所發(fā)揮的腦保護(hù)作用可能涉及到對整個線粒體工作網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，但是它們之間的作用機(jī)制還有待研究。

綜上所述，Res減輕小鼠腦組織I/R損傷，可能與其對線粒體自噬的調(diào)控，以最終確保線粒體質(zhì)量有關(guān)。本研究提示線粒體可能是治療腦中風(fēng)的重要靶點(diǎn)，因此，進(jìn)一步探討維護(hù)線粒體健康的調(diào)控機(jī)制，尋找相關(guān)藥物作用靶點(diǎn)，對防治腦缺血疾病具有借鑒意義。