尿石素A對糖尿病小鼠心肌細(xì)胞自噬的影響

朱小艷，周 友，岑慧裕，黃雅焱，高智敏，吳曉倩

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 511436)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病主要的心血管并發(fā)癥之一，獨(dú)立于高血壓、冠心病、心臟瓣膜病及其他已知心臟疾病而存在，是由糖代謝紊亂引起，以心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙為主要病理改變的一種心肌病變。DCM發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未被詳盡闡明[1]。現(xiàn)有研究證明，自噬在DCM進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用[2]。自噬是真核細(xì)胞內(nèi)受嚴(yán)格調(diào)控的溶酶體依賴性降解途徑，正常情況下，心肌細(xì)胞內(nèi)保持一種低水平的自噬，清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和老化受損的細(xì)胞器，為細(xì)胞提供營養(yǎng)，在饑餓缺血/缺氧應(yīng)激狀況下，自噬受到激活或抑制，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[3]。有研究表明，在DCM的發(fā)生、發(fā)展過程中激活自噬，能夠起到保護(hù)DCM的作用[4]。也有研究顯示，抑制自噬后，能夠?qū)CM的損傷進(jìn)行修復(fù)[5]。

尿石素A(urolithin A，UA)主要由富含鞣花單寧的植物(石榴、草莓、核桃模型、花生等)經(jīng)體內(nèi)腸道微生物代謝產(chǎn)生，具有抗炎、抗氧化等生物活性[6]，且在抗缺血/再灌注[7]、順鉑所致腎損害[8]等方面有積極作用。研究表明，UA能通過誘導(dǎo)自噬而延長線蟲的壽命，并通過增強(qiáng)自噬而改善嚙齒類動(dòng)物衰老性肌肉衰退功能[9]。另有研究表明，UA能夠通過激活PI3K/Akt通路，緩解心肌缺血/再灌注損傷[7]。UA對于DCM的影響及機(jī)制尚不十分清楚。本研究通過高糖處理乳鼠心肌細(xì)胞建立DCM細(xì)胞模型，觀察不同時(shí)間、不同濃度高糖刺激對乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)自噬的影響；建立DCM小鼠模型，探討UA能否改善糖尿病心肌病損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生1～3 d的SD乳鼠，♀♂不限，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；健康♂ C57BL/6小鼠,SPF級，50只，體質(zhì)量(20±5)g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物準(zhǔn)字號(hào):SYXK(粵)2016-0168。小鼠分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)參照中國動(dòng)物福利法案，經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.1.2試劑 DMEM低糖培養(yǎng)基、L-15細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶，購于美國Gibco公司；UA、鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、D-(+)-葡萄糖(glucose)、氯喹(chloroquine，CQ)，購于Sigma公司；MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒，購于南京凱基公司；鼠單抗GAPDH，抗兔或抗鼠二抗，購自北京中杉金橋；LC3一抗，購自美國Cell Signal Technology公司；p62一抗，購自Bioworld公司。

1.1.3儀器 低溫高速離心機(jī)(德國Hettich公司)；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州儀器廠)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP);自動(dòng)洗片機(jī)(美國Kodak)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng) 新生1～3 d乳鼠消毒1～2次，在超凈臺(tái)無菌條件下，用眼科剪沿左側(cè)肋骨打開胸腔暴露搏動(dòng)心臟，取出心臟，放入裝有30 mL預(yù)冷的HBSS離心管中，晃洗3遍至洗凈殘留血液。將洗凈殘留血液的心肌組織移至100 mm培養(yǎng)皿中，修剪出左心室心肌組織后，剪碎成均勻的1～2 mm小塊，加入預(yù)冷的8 mL HBSS和2 mL 0.25%的胰酶，4 ℃冰箱消化12～16 h。次日，加入2 mL的FBS終止消化后，加入終濃度為0.1%二型膠原酶，于37 ℃水浴搖動(dòng)45 min，取出加入L-15細(xì)胞培養(yǎng)基輕輕吹打組織，用500目濾網(wǎng)過濾后，于室溫中靜置20 min，離心，吹打成細(xì)胞懸液，種于100 mm培養(yǎng)皿中，放在正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置45 min進(jìn)行差速貼壁。取出培養(yǎng)皿，收集液體離心，棄上清，吹打成細(xì)胞懸液,接種細(xì)胞，24 h后換液，即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 為探討不同濃度高糖對心肌細(xì)胞的影響，乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：正常對照組(使用含葡萄糖5.5 mmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基)，葡萄糖(20、33、47 mmol·L-1)培養(yǎng)基刺激48 h組。為探討33 mmol·L-1葡萄糖對心肌細(xì)胞內(nèi)自噬的影響，乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：正常對照組(使用含葡萄糖5.5 mmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基)、33 mmol·L-1葡萄糖刺激48 h組、33 mmol·L-1葡萄糖刺激48 h+20 μmol·L-1CQ處理12 h組。為探討不同濃度UA對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)自噬的影響，乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：正常對照組(使用含葡萄糖5.5 mmol·L-1的DMEM培養(yǎng)基)、33 mmol·L-1葡萄糖+UA(5、10、15、20 μmol·L-1)刺激48 h組。

1.2.3糖尿病模型的制備 6～8周齡C57BL/6 ♂小鼠隨機(jī)分為正常對照組(CON組，8只)、正常+UA組(CON+UA 50 mg·kg·d-1，6只)、DCM模型組(DCM組，9只)、UA低、高劑量組(DCM+UA 25、50 mg·kg·d-1，各10只)。每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥10周。

1.2.4Western blot檢測 取等量的各組蛋白上樣，使用SDS-PAGE凝膠，在100 V恒壓下電泳，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1 h，一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，每次10 min,二抗室溫孵育1 h,PBST洗膜5次，每次10 min,取出膜，增強(qiáng)化學(xué)熒光發(fā)光試劑中反應(yīng)1 min,曝光成像后進(jìn)行掃描。

1.2.5MTT法檢測細(xì)胞存活性 按照說明書操作。酶標(biāo)儀在570 nm波長處檢測每孔的吸光度(A)值，按公式：細(xì)胞存活率%=處理組A值/對照組A值×100%,求出各組的存活率，重復(fù)3次。計(jì)算并評價(jià)細(xì)胞存活率。

1.2.6超聲測量心功能 采用加拿大VisualSonics生產(chǎn)的Vevo2100高分辨小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)，探頭頻率為250 MHz對小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測，觀察小鼠心臟結(jié)構(gòu)及其功能的變化。異氟烷麻醉小鼠后，仰臥固定于37 ℃恒溫加熱板上，持續(xù)吸入異氟烷。小鼠四肢與心電圖電極相連以監(jiān)測心率。脫毛，涂抹超聲波導(dǎo)聲劑，進(jìn)行超聲檢測，分別在短軸用M-Mode和在超聲四腔面用二尖瓣灌流模式，檢測小鼠心臟的收縮和舒張功能。超聲心動(dòng)圖各參數(shù)連續(xù)測量5個(gè)心動(dòng)周期，計(jì)算均值。

1.2.7常規(guī)Masson染色 將心臟組織經(jīng)冷PBS灌注后，置于4%多聚甲醛中固定24 h。常規(guī)石蠟包埋， 制作切片，連續(xù)切片(厚4 μm)，每5張取1張，每個(gè)標(biāo)本取3張切片。脫蠟后行Masson染色，通常心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)綠色，每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照，用Image-Pro Plus 5.0圖像處理系統(tǒng)測量膠原纖維陽性區(qū)占所觀察視野的面積比。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度高糖對心肌細(xì)胞存活率的影響Fig 1的MTT結(jié)果顯示，高糖條件下，乳鼠心肌細(xì)胞的存活率隨著葡萄糖濃度的升高而逐漸下降，在33 mmol·L-1葡萄糖刺激48 h后，乳鼠心肌細(xì)胞的存活率明顯下降，部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)。本研究選取的最佳高糖造模濃度是33 mmol·L-1。

2.2 不同濃度高糖對心肌細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響20、33、47 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基刺激乳鼠心肌細(xì)胞48 h，F(xiàn)ig 2結(jié)果表明，與對照組相比，在不同濃度高糖條件下，自噬相關(guān)蛋白LC3 II的表達(dá)增加，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加，自噬底物蛋白p62堆積(P<0.05)。提示高糖刺激后，心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體降解受阻，自噬流可能發(fā)生障礙。

Fig 1 Effect of different concentrations of high glucose(HG) on cell viability in neonatal rat

**P<0.01vscontrol

Fig 2 Effect of different concentrations of HG on expression of autophagy related proteins in

**P<0.01vscontrol

2.3 33 mmol·L-1葡萄糖對心肌細(xì)胞內(nèi)自噬的影響為進(jìn)一步探討高糖對心肌細(xì)胞內(nèi)自噬的影響，運(yùn)用自噬抑制劑CQ(溶酶體融合抑制劑)處理心肌細(xì)胞。Fig 3結(jié)果表明，與對照組相比，33 mmol·L-1葡萄糖處理心肌細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)LC3 Ⅱ的表達(dá)增加、LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加、自噬底物蛋白p62堆積(P<0.05)；添加CQ處理12 h后，與高糖組相比，細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白LC3 Ⅱ及p62的表達(dá)并無明顯差異，沒有額外的LC3 Ⅱ及p62堆積。提示33 mmol·L-1葡萄糖刺激48 h后，心肌細(xì)胞內(nèi)自噬流已發(fā)生障礙，自噬體與溶酶體融合受阻。

Fig 3 Effect of 33 mmol·L-1 HG on expression of autophagy related proteins in neonatal rat

**P<0.01vscontrol

2.4 不同濃度UA對心肌細(xì)胞存活率的影響應(yīng)用不同濃度的UA作用于正常條件下的乳鼠心肌細(xì)胞，F(xiàn)ig 4的MTT結(jié)果表明，以對照組(葡萄糖5.5 mmol·L-1)細(xì)胞存活率為100%作為參照，隨著UA濃度的增大，乳鼠心肌細(xì)胞的存活率下降，UA(40 μmol·L-1)刺激48 h后，存活率下降與對照組比較差異具有顯著性(P<0.05)。

2.5 UA對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)選擇5～20 μmol·L-1的UA，在33 mmol·L-1高糖培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，給予不同濃度的UA干預(yù)48 h。Fig 5的Western blot顯示，乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)過高糖刺激48 h后，自噬底物p62堆積,LC3 Ⅱ表達(dá)、LC3 Ⅱ/Ⅰ比值明顯增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給予UA后，自噬底物p62堆積減少,隨著UA濃度的提高，細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ表達(dá)、LC3 Ⅱ/Ⅰ比值逐漸下降，與高糖組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示UA對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)自噬流障礙有改善作用。

2.6 UA對糖尿病小鼠心功能的影響Fig 6的超聲結(jié)果顯示，DCM組E/A峰下降明顯，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；UA(25、50 mg·kg·d-1)組E/A值升高(P<0.05)，提示UA對糖尿病小鼠心臟舒張功能有改善作用。

Fig 4 Effect of urolithin A on cell viability in neonatal

**P<0.01vscontrol

Fig 5 Effect of UA on expression of autophagy related proteins in neonatal rat cardiomyocytes induced by high

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG

Fig 6 Effect of UA on cardiac function

*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsDCM

2.7 UA對糖尿病小鼠心肌膠原纖維沉積的影響灌胃給藥10 周后，麻醉處死動(dòng)物，取部分心臟橫截面組織制作病理切片，采用Masson染色檢測左心室橫切面膠原分布情況。如Fig 7所示，對照組與CON+UA50組左心室心肌間血管和心肌間質(zhì)可見少許膠原纖維沉積；DCM小鼠的膠原纖維沉積更加明顯，UA組膠原沉積減少。用Image-Pro Plus 5.0圖像處理系統(tǒng)測量膠原纖維陽性區(qū)占所觀察視野的面積比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，DCM組小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增多(P<0.05)；與DCM組比較，DCM+UA組小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維明顯減少(P<0.05)。

3 討論

DCM是在1972年由Rubler等[10]首次提出，他研究記錄了4例心力衰竭患者除了糖尿病外無其他心血管疾病(冠心病、高血壓等)，可引起心力衰竭，通過反復(fù)研究進(jìn)而提出了DCM這一概念。DCM早期的病理表現(xiàn)為舒張功能降低，后逐漸出現(xiàn)心臟收縮功能受損，最終發(fā)展為心力衰竭，致殘致死率極高。DCM過程中的相關(guān)分子機(jī)制極為復(fù)雜，糖基化終產(chǎn)物的蓄積、氧化應(yīng)激的發(fā)生、炎癥因子信號(hào)通路的啟動(dòng)、自噬等都參與其中[10]。現(xiàn)有研究認(rèn)為，自噬在DCM進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用[2]。自噬被分為三大類，包括巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬，本實(shí)驗(yàn)所指的為巨自噬。自噬在真核細(xì)胞是受多種信號(hào)分子調(diào)控的動(dòng)態(tài)過程，由自噬體的形成、膜的延伸以及自噬溶酶體降解等多個(gè)環(huán)節(jié)組成，其整個(gè)過程又被稱之為自噬流。我們前期研究也已經(jīng)證實(shí)，急性心梗后心肌細(xì)胞自噬被迅速激活，但持續(xù)缺血會(huì)引起自噬流障礙[11]，改善自噬流障礙可發(fā)揮抗心肌缺血損傷的作用[12]。在此基礎(chǔ)上，我們探討在糖尿病細(xì)胞模型上，自噬該如何改變，UA在DCM模型上能否通過影響自噬來改善DCM。

糖代謝異常是DCM的始發(fā)因素，高血糖在DCM形成過程中起關(guān)鍵作用，高糖狀態(tài)下，心肌肥大、心肌細(xì)胞凋亡、心肌間質(zhì)纖維化發(fā)生[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，33 mmol·L-1高糖可致乳鼠心肌細(xì)胞存活率明顯降低，同時(shí)使細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白LC3 Ⅱ及自噬底物p62水平增加，LC3 Ⅱ水平的增加可能是自噬水平增高導(dǎo)致自噬體增多，或是自噬體降解減少導(dǎo)致自噬體堆積[13]。自噬底物p62能與LC3 Ⅱ結(jié)合，在自噬溶酶體降解，自噬蛋白LC3 Ⅱ及p62水平同時(shí)增加，說明自噬體與溶酶體融合受阻。為了進(jìn)一步研究在高糖條件下心肌細(xì)胞內(nèi)自噬狀態(tài)，用溶酶體融合抑制劑氯喹作用于高糖細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)并沒有額外的LC3 Ⅱ及p62的堆積，說明在33 mmol·L-1高糖處理48 h條件下，心肌細(xì)胞內(nèi)自噬流已發(fā)生障礙。

UA是富含鞣花單寧的植物在機(jī)體腸道的代謝產(chǎn)物，有研究證明，UA可通過誘導(dǎo)自噬，延長線蟲的壽命及改善嚙齒類動(dòng)物的肌肉功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在高糖細(xì)胞模型上給予UA后，自噬蛋白LC3 Ⅱ及自噬底物p62水平下降，改善了細(xì)胞內(nèi)自噬流障礙，糖尿病動(dòng)物模型小鼠超聲心功能及Masson染色均顯示，UA有改善DCM作用。有研究表明，二甲雙胍通過增強(qiáng)自噬，改善糖尿病心肌損傷[14]。腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)激活促進(jìn)Bcl-2/Beclin-1復(fù)合物解離，并發(fā)揮抗糖尿病心肌細(xì)胞凋亡作用[15]。這些研究都提示，改善自噬可發(fā)揮抗糖尿病心肌損傷作用。

綜上所述，UA可起到保護(hù)DCM的作用，其機(jī)制可能與改善心肌細(xì)胞內(nèi)自噬流障礙有關(guān)。本研究為開發(fā)新型抗糖尿病心肌損傷的藥物研究提供了新的理論基礎(chǔ)。