基于雌激素受體探討梓醇對抗糖剝奪心肌細胞損傷的作用

王素云，盧 穎，蔡丹鳳，童 靜，成 鵬，余夕潮，李 育，卞慧敏

(南京中醫藥大學 1. 藥學院、2. 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室、3. 醫學與生命科學學院，江蘇 南京 210023)

近年來研究表明，心肌細胞在缺血缺氧狀態下，線粒體內會產生大量氧自由基，氧自由基生成及脂質過氧化反應增強是心肌損傷的主要機制之一[1]，積累的活性氧(reactive oxygen species,ROS)可損傷線粒體。因此，適時地清除老化和發生損傷的線粒體對于細胞的正常生長具有非常重要的作用[2]。研究發現，自噬可以用來清除受損的細胞器，在自由基的刺激下，可被特異性的自噬過程降解，從而減少細胞氧化損傷[3-4]，因此，細胞通過基礎水平的自噬以維持胞質內線粒體的更新。現代藥理研究證實，梓醇(catalpol)是地黃中發揮藥理作用的主要活性成分之一，梓醇具有神經保護、抗炎的作用，能提高腦缺血/再灌注動物模型的學習記憶能力，抑制細胞凋亡，減少神經元死亡等[5-6]，但是梓醇對于心血管系統保護作用研究尚處于起步階段。前期研究中，利用分子對接技術，對地黃中單體進行雌激素受體(estrogen receptor, ER)調節劑篩選時，發現梓醇與ERα、ERβ結合率較高，但是對于梓醇能否通過ER介導細胞自噬，抑制心肌損傷尚不明確。故本研究利用糖剝奪心肌細胞氧化損傷模型，探討梓醇對心肌細胞的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 大鼠心肌細胞株H9c2，購自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2試劑 梓醇(貨號：L26D6Y8111)，購自上海源葉生物科技公司；胎牛血清(貨號：1619679)、DMEM培養基(貨號：C11995500BT)、無糖培養基(貨號：1710161)，均購自Gibco公司；LC3抗體(貨號：66139-1-1g)，購自CST公司；Beclin-1抗體(貨號：1306-1-AP，Proteintech公司)；p62(貨號：ab91526)、Parkin(貨號：ab15954)、PINK1(貨號：ab23707)抗體、ERα抗體(貨號：ab32063)，ERβ抗體(貨號：ab92306)，均購自美國Abcam公司；雌激素受體α抑制劑(MPP)(貨號：072M4702V)、雌激素受體β抑制劑(PHTPP)(貨號：065M4603V)，均購自sigma公司；活性氧(ROS)試劑盒(貨號：S0033)，購自上海碧云天生物技術有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號：A001-1)、丙二醛(MDA)試劑盒(貨號：A003-1)，均購自南京建成生物工程研究所；siNTC(貨號：Y007)、siERα(貨號：Y3512)，購自上海和元生物技術有限公司。

1.1.3儀器 Synergy2酶標儀(Bio-Tek公司)；熒光倒置顯微鏡(ZEISS公司)；5417R低溫超速離心機(Eppendorf公司)；蛋白電泳、轉移設備(Bio-Rad公司)；自動曝光儀(Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養與分組H9c2心肌細胞于用含體積分數10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度培養，當細胞融合達80% ～ 90%時，用胰蛋白酶消化，并用培養基配成細胞懸液，6孔板每孔鋪 1×106 cells/mL，待細胞長至70%時，吸去細胞上清，加入含藥培養基。雌激素抑制劑實驗將細胞分為 5 組：對照組、模型組、梓醇(28 μmol·L-1)+MPP(10 μmol·L-1)組、梓醇(28 μmol·L-1)+THTPP(10 μmol·L-1)組。慢病毒轉染實驗將細胞分為 7組：對照組、模型組、梓醇(28 μmol·L-1)、siNTC組、siNTC+梓醇組(28 μmol·L-1)、siERα組、siERα組+梓醇組(28 μmol·L-1)。以上均為藥物終濃度。于5% CO2、37℃下培養24 h后，糖剝奪6 h對細胞進行無糖饑餓處理，空白對照用正常培養基培養。

1.3 MTT法檢測H9c2細胞存活率待細胞長至70%時，吸去細胞上清，加入含藥培養基。細胞分為對照組、不同濃度梓醇組(終濃度0.28、2.8、28、280、2 800 μmol·L-1)。于5% CO2、37 ℃培養24 h。24 h后，吸去細胞上清，PBS緩沖液洗滌3次，每孔加入完全培養基180 μL及MTT 20 μL，避光，37 ℃ 孵育4 h，每孔加150 μL DMSO溶解孔內結晶物，避光，搖床上振蕩15 min，于酶標儀490 nm下測吸光度(OD)值。

1.4 H9c2細胞ROS、MDA、SOD活力的檢測取出經糖剝奪6 h及藥物作用24 h后的心肌細胞，按照ROS、MDA、SOD試劑盒說明書檢測。

1.5 電鏡觀察收集細胞，離心，經2.5%戊二醛固定后送檢，透射電子顯微鏡觀察細胞中自噬小體的結構。

1.6 Western blot檢測自噬蛋白表達待細胞長至70%時，吸去細胞上清，PBS洗3次，將細胞分為空白對照組、模型組、梓醇(0.28、2.8、28 μmol·L-1)組。于5% CO2、37 ℃培養24 h后，糖剝奪6 h對細胞進行無糖饑餓處理，細胞裂解液裂解細胞，離心后，上清用BCA法測定蛋白濃度，蛋白定量60 μg，煮沸5 min，上樣于10% SDS-PAGE膠，電泳1.5 h，全濕式電轉將蛋白轉移到PVDF膜上。室溫下用含5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗(1 ∶1 000)、二抗(1 ∶1 000)，化學發光檢測目的條帶，在凝膠成像系統上觀察分析并拍照。用目的蛋白與內參蛋白的灰度值之比計算蛋白表達水平。

1.7 慢病毒轉染胰酶消化H9c2細胞配成細胞懸液，6孔板每孔鋪2×105cells/mL，24 h后匯合度30%左右(分組同“1.2”)，感染病毒siNTC和siERα，加polybrene，感染20 h后棄去培養基，每孔加入2 mL新鮮的培養基。感染72 h后，吸去細胞上清，加入含藥培養基，于5% CO2、37 ℃培養24 h后，糖剝奪6 h對細胞進行無糖饑餓處理，空白對照依然用正常培養基培養。

2 結果

2.1 梓醇對糖剝奪誘導的H9c2心肌細胞氧化損傷的影響細胞毒性實驗結果表明(Fig 1A)，當梓醇終濃度超過280 μmol·L-1時，出現明顯抑制細胞生長的作用。0.28、2.8、28 μmol·L-1的梓醇對糖剝奪誘導H9c2損傷均有保護作用(Fig 1B)，且呈劑量依賴性。糖剝奪后ROS的水平明顯升高(Fig 1C)，MDA含量明顯升高，SOD活性明顯降低(Fig 1D、1E)；給予梓醇處理后，能明顯降低心肌ROS的水平和MDA含量，升高SOD活性，且呈劑量依賴性。電鏡觀察顯示(Fig 1F)，與空白對照組比，糖剝奪組作用后能觀察到腫脹破損的線粒體；與糖剝奪組比，給予梓醇干預后出現明顯的自噬小體，典型的自噬小體中還可看到包含破損的線粒體。

Fig 1 Effect of catalpol on oxidative damage of H9c2 cells induced by glucose n=6)

A: Survival rate of H9c2 cardiomyocytes; B: Protective effect of catalpol on H9c2; C: Release of ROS; D and E: Release of MDA and SOD; F: Electron microscopic observation results. Arrows indicate autophagosome.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

2.2 梓醇對糖剝奪誘導的H9c2細胞中ER的影響Fig 2結果表明，與空白對照組相比，糖剝奪組ERα、ERβ表達明顯降低；不同濃度梓醇處理后，H9c2細胞中ERα、ERβ蛋白表達均升高，表明梓醇能提高受損心肌細胞的ER蛋白的表達量。

2.3 梓醇對糖剝奪誘導的H9c2細胞氧化損傷的保護作用是通過ERα介導的實驗結果表明(Fig 3A、3B)，梓醇能夠明顯增加SOD活性，降低MDA含量，加入MPP(ERα抑制劑)能明顯逆轉梓醇的作用(P<0.01)，而PHTPP(ERβ抑制劑)卻不能阻斷梓醇的作用。同時，MPP也能明顯逆轉梓醇對自噬相關蛋白Beclin-1、LC3(Fig 3C、3D)，以及線粒體自噬相關蛋白Parkin、p62、PINK1(Fig 3E、3F)的調節作用(P<0.01)，同樣PHTPP卻沒有這種逆轉作用。說明ER介導的梓醇抗氧化、上調自噬的作用與ERα密切相關。

Fig 2 Effects of catalpol on estrogen receptors in H9c2 cells induced by glucose deprivation n=3)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.4 siRNA ERα后梓醇對糖剝奪H9c2細胞自噬的影響為了進一步驗證ERα與自噬及線粒體自噬的關系，用慢病毒轉染H9c2細胞干擾ERα表達。免疫熒光及Western blot鑒定ERα轉染結果表明(Fig 4A、4B)，當MOI值達到60時，免疫熒光轉染率達到近80%，ERα表達明顯減少。慢病毒干擾ERα后，觀察梓醇對氧化損傷的影響，結果表明(Fig 4C、4D)，與SiNTC+catalpol相比，siERα干擾后給予梓醇能部分降低MDA含量，增加SOD的含量，抗氧化作用被部分逆轉。Western blot實驗結果表明(Fig 4E、4F)，與SiNTC+catalpol相比，siERα干擾后能部分逆轉梓醇上調Beclin-1、LC3、Parkin表達，下調p62、PINK1表達的作用，說明ERα介導了梓醇調節自噬及線粒體自噬對抗糖剝奪誘導的心肌損傷。

3 討論

心肌缺血將造成心肌缺血供氧不足，不僅易引發心絞痛、冠心病、心衰等，甚至可能導致死亡。心肌細胞屬于終末細胞系，缺乏再生能力，減少心肌損傷以及修復損傷后的心肌細胞尤為重要。線粒體是機體內源性自由基產生的主要部位，而損傷和功能失調的線粒體可產生大量的ROS，超出正常水平的ROS誘導氧化應激會損害細胞，導致線粒體損傷及膜電位的降低[7]，進一步加重心肌缺血。本實驗結果表明，給予梓醇處理后可降低心肌細胞氧化損傷，有效清除自由基，并且能明顯降低MDA含量，升高SOD活性，起到保護心肌細胞的作用。

在心肌細胞中，抗霉素A(antimycin A,AMA)通過增加線粒體超氧化物產生，減少線粒體膜勢能及減少細胞內呼吸作用，促進心肌細胞損傷，而雷帕霉素通過mTOR途徑誘導自噬，提高線粒體功能，促進受損線粒體清除，保護心肌細胞免受AMA的毒害作用[8]。此外，在酵母中,當基因突變使線粒體無法維持跨膜電勢時，線粒體自噬水平明顯上調，損傷線粒體被特異性地清除[9]。多種心血管疾病(如心肌病、心臟缺血/再灌注損傷、心功能不全等)的存在心肌細胞自噬現象[10]。我們的實驗結果也證實，梓醇能有效促進自噬小體的形成，明顯增加自噬相關蛋白Beclin-1及LC3的蛋白表達，并能增加線粒體自噬相關蛋白表達，降低MDA水平，說明梓醇能通過增強糖剝奪誘導的心肌損傷中自噬水平，減輕氧化損傷，保護心肌細胞。

研究發現，植物雌激素能夠促進自噬的發生[11-12]。在心肌肥厚模型中給予葛根素治療，可明顯上調自噬標志性蛋白LC3表達，并在體外培養的H9c2細胞中呈現濃度依賴的特點[13]。Duan等[14]研究發現，白藜蘆醇可以通過激活SIRT3/AMPK信號轉導通路，促進線粒體自噬，修復巨噬細胞氧化損傷；也可以上調缺血皮質區腦組織LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達，發揮對缺血/再灌注大鼠神經元的保護作用。因此推測，植物雌激素對自噬的調控是通過ER介導的。本實驗表明當ERα被抑制后，自噬及線粒體自噬也被抑制。梓醇能有效調節ERα的表達，進而促進自噬與線粒體自噬，發揮對糖剝奪誘導心肌損傷的保護作用。

綜上所述，梓醇上調自噬發揮對心肌損傷保護的作用是由ERα調控的。本研究有助于揭示植物雌激素樣成分可通過ERα促進自噬及線粒體自噬，為揭示植物雌激素樣成分抗心肌損傷的科學內涵提供依據。

Fig 3 Effect of catalpol on oxidative damage autophagy induced by glucose deprivation in H9C2 cells after ERα and ERβ blockade

A and B: Release of MDA and SOD (n=6); C and D: Western blot results and the quantitative data of Beclin-1 and LC3(n=3); E and F: Western blot results and the quantitative data of p62, Parkin and PINK1 (n=3).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vscatalpol group.

Fig 4 Effect of catalpol on glucoside deprivation H9c2 autophagy after siRNA ERα

A: Identification of siERα fluorescence in H9c2 cells; B: Western blot verified the successful ERα transfection (n=3); C and D: Release of MDA and SOD (n=6); E and F: Western blot results and quantitative data (n=3). 1:Control;2:Model; 3: catalpol;4:siNTC;5: siNTC+catalpol;6: siERα;7: siERα+ catalpol.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vssiNTC+ catalpol group.

(致謝：本課題在江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室完成，特別感謝實驗的指導老師及各位參與者！)