二烯丙基二硫誘導人胃癌MGC803細胞的差異microRNA表達

唐 儀，唐云云，劉 芳，蘇 堅,4，夏 紅，曾 希，蘇 琦

(1. 南華大學腫瘤研究所，湖南省腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，湖南省胃癌研究中心，湖南 衡陽 421001；2. 南華大學附屬湘潭醫院病理科，湖南 湘潭 411101；3. 永州職業技術學院基礎醫學系，湖南 永州 425100；4. 南華大學附屬第二醫院病理科，湖南 衡陽 421001)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，據2018年全世界185個國家統計的最新報告，每年新發病例100萬，死亡78.3萬，發生率與死亡率分別居于第5位與第3位[1]。我國是胃癌高發地區，每年約新發67.9萬，死亡49.8萬，發生率與死亡率僅次于肺癌，由于患者就診時大多已發生侵襲轉移，常規手術和化療效果較差，故5年生存率低[2]。因此，研發高效低毒藥物與胃癌的早期診斷對提高胃癌的治療效果，延長患者的生存期至關重要[3]。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)作為大蒜中烯丙基硫化物的一種脂溶性的有效成分，對多種腫瘤均有明顯的抑制作用[4]。近年來，microRNAs(miRNAs)在腫瘤中的作用引起人們高度關注。miRNAs在腫瘤中通過與靶基因mRNA的3′非編碼區完全或不完全結合，表現為癌基因或抑癌基因作用[3]。本研究采用miRNA芯片與qRT-PCR，檢測與鑒定DADS抑制人胃癌MGC803細胞的差異miRNAs表達。

1 材料與方法

1.1 細胞培養人胃癌MGC803、BGC823、MKN28、SGC7901、HGC27細胞，以及正常胃黏膜上皮GES-1細胞，由本實驗室保存，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內傳代培養。取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2 試劑DADS為Fluka公司產品；miRCURYTMArray Power標記試劑盒，由上海康成生物公司提供；qPCR miRNA試劑盒，購自上海吉瑪公司；RPMI 1640培養液，購自Hyclone公司；胎牛血清，購自四季青生物公司。

1.3 microRNA芯片檢測30 mg·L-1DADS處理24 h的MGC803細胞與未處理的MGC803細胞，分別取1×106～1×107細胞，加1 mL的RNA抽提試劑TRIzol，裂解后抽提RNA，檢測RNA純度及完整性。制備熒光標記探針：采用miRCURYTMArray Power標記試劑盒，用標記酶將Hy3TM或Hy5TM熒光基團標記miRNA，得到用于與芯片雜交的熒光探針。芯片雜交：在標準條件下，使用PhalanxTM的熱收縮雜交袋，將標記號的探針和miRCURYTM芯片雜交。GenePix4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強度，并將實驗結果轉化成數字型數據保存，用配套軟件對原始數據進行分析運算。

1.4 qPCR檢測用RNA抽提試劑盒抽提組織與細胞總RNA，qPCR miRNA試劑盒逆轉錄合成cDNA存于-80 °C。miR-200b：5′-UAAUACUGCCUG GUAAUGAUGA-3′；miR-22：5′-AAGCUGCCAGUUGA AGAACUGU-3′；所有miRNA序列由美國Exiqon公司合成。采用美國 Illumina公司(Eco)qRT-PCR儀檢測。PCR擴增反應體系：2×SYBR Mix 10 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，MiR-PCR primers 0.4 μL，miRNA RT product 2.0 μL，滅菌蒸餾水7.4 μL。上機：95.0 ℃，3 min；95.0 ℃，12 s；62.0 ℃，35 s；(62.0～95.0) ℃，15 s，共40個循環。反應結束后，軟件自動分析并顯示循環閾值(CT)和實時定量熒光動態曲線。

1.5 臨床胃癌標本收集南華大學附屬第一醫院在無任何輔助治療的情況下，手術中的27例配對的原發胃癌和鄰近的非胃癌組織。所有組織標本HE染色，經兩名獨立病理學家診斷。所有患者均獲得知情同意書，并經華南大學研究倫理委員會批準。

2 結果

2.1 DADS作用MGC803細胞miRNAs差異表達microRNA芯片檢測顯示，30 mg·L-1DADS處理24 h的MGC803細胞的差異miRNAs表達中，發現7個miRNA上調，5個miRNA下調(Fig 1、Tab 1)。

2.2 qRT-PCR檢測上調miRNAs進一步采用qRT-PCR驗證上調miRNAs。Fig 2結果顯示，30 mg·L-1DADS處理人胃癌MGC803細胞后，miR-200b、miR-22、miR-7、miR-143、miR-138、miR-34a、miR-150等表達較未處理組明顯上調(P<0.05)，與miRNA芯片檢測結果一致。

2.3 miR-200b與miR-22在人胃癌細胞表達根據DADS處理人胃癌MGC803細胞后，miR-200b與miR-22上調最明顯，因此，采用qPCR進一步驗證miR-200b與miR-22是否在各種人胃癌細胞表達上調。Fig 3檢測結果顯示，miR-200b與miR-22在MGC-803、BGC-823、MKN-28、SGC-7901、HGC-27等各種人胃癌細胞表達較正常人胃癌GES-1細胞明顯下調(P<0.05)。

Fig 1 MGC803 cells treated by DADS detected by miRNA chip

Tab 1 The differential expression of miRNAs in MGC803 cells treated by DADS

Fig 2 Up-regulated miRNAs in gastric cancer

*P<0.05vsmock

2.4 miR-200b與miR-22在胃癌組織中表達為了明確miR-200b與miR-22在胃癌組織的表達情況，采用qPCR檢測。Fig 4結果顯示，miR-200b與miR-22在胃癌組織中表達較正常胃組織明顯下調(P<0.05)。

Fig 3 Expression of miR-200b and miR-22 in gastric cancer cells detected by

*P<0.05vsGES-1

Fig 4 Expression of miR-200b and miR-22 in gastric cancer detected by

*P<0.05vsnormal

3 討論

研究發現，黃酮類化合物白楊黃素具有抑制胃癌細胞增殖的作用，白楊黃素可改變miRNAs的表達，上調miR-22、miR-34a、let-7a、miR-9、miR-126，下調miR-21、miR-18a、miR-221，可能是其作用的分子機制[5]。本研究采用microRNA芯片檢測結果顯示，DADS處理人胃癌MGC803細胞的差異miRNAs表達中，miR-200b、miR-22、miR-7、miR-143、miR-138、miR-34a、miR-150等表達上調，而miR-21、miR-222、miR-15b、miR-182、miR-18a等表達下調。且qPCR驗證7個上調的miRNA在DADS處理MGC803細胞較未處理組明顯上調，與芯片檢測結果一致。進一步檢測上調最為明顯miR-22與miR-200b在各組胃癌細胞和組織中表達明顯下調。

研究顯示，胃癌組織中miR-22的表達率較正常組織明顯降低，表明miR-22可能是早期檢測胃癌的良好診斷生物標志物[6]。有研究證明，胃癌患者血清中miR-22的水平較健康對照組明顯降低，相反，miR-21的水平明顯高于對照組。生物信息學分析顯示，Sp1是miR-21靶點，而PTEN是miR-22的靶點，提示其是胃癌潛在的生物標志物[3]。幽門螺桿菌感染是慢性炎癥導致胃癌發生的主要原因，而NLRP3在炎癥發生過程中起著至關重要的作用。幽門螺桿菌感染可抑制miR-22的表達，促進NLRP3的表達，從而引發了上皮細胞失控的增殖和胃癌發生。然而，miR-22可直接靶向NLRP3，在體內外降低其致癌作用。因此，miR-22抑制NLRP3并維持胃微環境穩態的機制，可作為胃癌干預的潛在靶點[7]。我們發現，miR-22在胃癌中表達下調，與臨床分期和淋巴結轉移有關，miR-22可通過靶向metadherin抑制MGC803細胞侵襲與轉移[8]。DADS可上調miR-22，通過Wnt-1通路明顯抑制MGC803細胞增殖與遷移侵襲[9]。

miR-200b是一種在腫瘤進展過程中具有多效作用的microRNA與治療靶點。miR-200b通過誘導G2期阻滯和凋亡，抑制食管鱗狀細胞癌(ESCC)細胞的生長。CDK2和PCNA相關因子(PCNA-associated factor, PAF)是miR-200b直接的靶點，ESCC中CDK2和PAF水平均較正常組織明顯升高，與miR-200b的頻繁缺失和生存率明顯降低有關[10]。Zheng等[11]采用薈萃分析1 271例食管癌、3467例胃癌和1517例結直腸癌患者，鑒定59個miRs，發現miR-200b與胃腸癌患者預后不良相關。在173例胃癌標本中，miR-200b低表達組的預后明顯低于miR-200b高表達組，并與腹膜轉移相關。癌癥相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)可促進miR-200b的表觀遺傳改變，降低miR-200b的表達，增加胃癌細胞侵襲和遷移[12]。胃癌組織和正常組織的miRs差異表達圖譜顯示，miR-200家族在胃癌中表達下調，且miR-200家族在癌組織中的表達明顯低于非癌組織，與組織學分級和血管內侵襲有關。因此，miR-200家族可能成為胃癌的預后預測因子與治療靶點[13]。miR-200b是胃癌、乳腺癌、卵巢癌、膠質瘤等多種腫瘤的抑制因子。miR-200b在膠質瘤組織中下調與預后不良相關，可能是神經膠質瘤預后的潛在生物標志物[14]。我們研究顯示，miR-200b在胃癌組織中表達下調與患者臨床分期、T分期、淋巴結轉移及生存率明顯相關。miR-200b高表達可直接靶向DNMT3A、DNMT3B和SP1，引起DNMT1、DNMT3A和DNMT3B表達降低，反過來通過啟動子DNA低甲基化，導致p16、RASS1A1和E-cadherin重新表達，提示miR-200b可能成為胃癌預后的標志物與治療的靶點[15]。

綜上所述，DADS誘導人胃癌MGC803細胞的差異miRNAs表達，有7個miRNA明顯上調，5個miRNA下調，DADS可上調MGC803細胞miR-200b與miR-22表達。然而，DADS是否能夠通過上調miR-7、miR-143、miR-138、miR-34a、miR-150和下調miR-21、miR-222、miR-15b、miR-182、miR-18a，抑制胃癌細胞增殖與遷移侵襲，尚待進一步研究。