PI3K/Akt通路在缺氧活化鈣敏感受體介導的A549細胞轉移中的作用

李光偉，王 珺，肖 薇，金 莉，李 波，趙 宇，張寧寧，汪 娜

(齊齊哈爾醫學院病理生理學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

肺癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。鈣離子與鈣信號轉導在肺癌發生中起重要作用，但其具體機制尚未闡明。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)是細胞膜上的一種G蛋白偶聯受體[2]，其在腫瘤的發生中發揮著重要作用，但CaSR在肺癌轉移中的作用鮮有報道。我們前期研究發現，CaSR蛋白在人非小細胞肺癌組織中表達增強，其表達強度與腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結轉移情況有關，提示在非小細胞肺癌中，CaSR的表達可能與腫瘤細胞的增殖及侵襲、轉移密切相關[3]。為探究CaSR在肺癌轉移中的具體機制，本實驗以A549及A549/DDP細胞為研究對象進行研究，以期為肺癌的防治提供新的藥物作用靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞人肺腺癌細胞A549、耐順鉑人肺腺癌細胞A549/DDP，購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 試劑與儀器基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)ELISA試劑盒，購于美國R&D公司；Transwell小室，購于Corning公司；CaSR、MMP-2、Akt、p-Akt、GAPDH的一抗及二抗，均購于Santa Cruz公司；LY294002(PI3K/Akt通路抑制劑)、NPS2143(CaSR抑制劑)、GdCl3(CaSR激動劑)，購于Sigma公司。缺氧培養箱及酶標儀(Thermo)；倒置顯微鏡(Olympus)；DF-D型恒壓恒流電泳儀(北京六一廠)；高速離心機(美國Sigma公司)；化學發光成像系統(上海天能科技有限公司)。

1.3 實驗分組及缺氧模型的復制A549及A549/DDP細胞在37 ℃、5% CO2條件下，含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養基中培養，順鉑維持濃度為2 mg·L-1。將處于對數生長期的細胞隨機進行分組。對照組(control)：細胞無血清培養24 h后，正常培養箱無血清培養24 h；缺氧組(H)：細胞無血清培養24 h后，缺氧箱內無血清培養24 h(93% N2、2% O2、5% CO2)；GdCl3干預組(H+Gd)：細胞無血清培養24 h，加入GdCl3(300 μmol·L-1)后，缺氧箱內無血清培養24 h；NPS2143干預組(H+NPS)：細胞無血清培養24 h，加入NPS2143(10 μmol·L-1)后，缺氧箱內無血清培養24 h；LY294002干預組(H+LY+Gd)：細胞無血清培養24 h，加入LY294002(10 μmol·L-1)孵育30 min后，加入GdCl3(300 μmol·L-1)，缺氧箱內無血清培養24 h[4]。

1.4 Western blot檢測CaSR、MMP-2、Akt、p-Akt的蛋白水平各細胞組達到實驗終點后，細胞刮下后，加入蛋白裂解液及PMSF，冰上孵育40 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，上清進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，300 mA轉移2 h至硝酸纖維素薄膜，封閉1 h；分別加入一抗MMP-2、Akt、p-Akt、GAPDH(1 ∶500)4 ℃過夜。洗膜，二抗(1 ∶1 000)孵育1 h，顯色發光，吸光度掃描，半定量分析顯影條帶[5-7]。

1.5 ELISA法檢測MMP-2含量收集各組細胞上清液，1 500 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL待測。實驗步驟按ELISA試劑盒說明書進行。所有標本均進行3個復孔檢測，并為同批測定，均值為終質量濃度。分別以標準物的質量濃度及450 nm波長的吸光度(A)值為橫縱坐標，在半對數坐標紙上繪出標準曲線。在坐標曲線上通過樣品A值，查出相應的樣品質量濃度(μg·L-1)[8]。

1.6 Transwell小室檢測細胞侵襲情況按照基質膠 ∶DMEM=1 ∶29比例稀釋后，向上室鋪基質膠。細胞分組同“1.3”，各組細胞分別離心后用無血清培養基重懸，調整細胞懸液濃度1.0×109·L-1種于上室，下室加入含有10% FBS的完全培養基600 μL，按照分組情況，分別于上室內加藥后置于常氧及缺氧箱內培養24 h；將上室取出，用棉簽擦去上室內未遷移的細胞，PBS沖洗2次；甲醇固定上室細胞20 min；PBS沖洗2次，適當風干后，0.5%結晶紫染色20 min，PBS沖洗2次，風干。倒置顯微鏡高倍鏡下任意選取5個不相同的視野，拍照并計數細胞[9]。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移情況細胞分組同“1.3”。取2塊6孔板，用marker筆分別在每塊板背面劃橫線，每隔0.5～1 cm劃一道，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。每孔加入約5×105個細胞，以過夜能鋪滿為標準，細胞貼壁后去血清24 h。次日用200 μL的槍頭比著直尺，垂至于背后的橫線劃痕。PBS沖洗3次，去除劃下的細胞，按分組情況分別處理及加藥，其中一塊板置于正常培養箱內，另一塊板置于缺氧箱內，分別培養24 h。取樣，拍照[10]。分別測量0 h和24 h的劃痕寬度，遷移距離=0 h的劃痕寬度-24 h的劃痕寬度。

2 結果

2.1 不同處理因素對CaSR表達的影響如Fig 1所示，與對照組比較，H組CaSR表達增加(P<0.05)；與H組比較，GdCl3能增加CaSR表達(P<0.05)，CaSR抑制劑NPS2143的作用相反，A549/DDP細胞CaSR蛋白表達結果與A549細胞一致。

Fig 1 The protein expression of CaSR determined by Western blot in different groups of A549 and A549/DDP

H: hypoxia, NPS: NPS2143.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group.

2.2 不同處理因素對細胞MMP-2蛋白表達的影響如Fig 2所示，與對照組比較，H組MMP-2蛋白表達增加(P<0.05)；與H組比較，缺氧基礎上GdCl3和NPS2143分別能上調和下調這種作用(P<0.05)；與H+GdCl3組比較，LY294002能夠抑制MMP-2蛋白的表達上調(P<0.05)，A549/DDP細胞MMP-2的變化趨勢與A549細胞一致。

2.3 不同處理因素對p-Akt蛋白水平的影響2種細胞Western blot檢測結果顯示(Fig 3)，與對照組比較，缺氧能夠上調Akt蛋白磷酸化水平(P<0.05)；與H組比較，缺氧基礎上GdCl3能夠進一步增加其磷酸化的水平(P<0.05)；與H+GdCl3比較，這種促進效應可以被PI3K通路阻斷劑LY294002抑制(P<0.05)；NPS2143則與GdCl3作用相反。

Fig 2 The protein levels of MMP-2 in A549 and A549/DDP cells determined by Western

H: hypoxia; NPS:NPS2143; LY: LY294002.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group.

Fig 3 The protein levels of p-Akt in A549 and A549/DDP cells

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

2.4 不同處理因素對細胞分泌MMP-2的影響如Fig 4所示，H組A549及A549/DDP細胞上清液中的MMP-2蛋白濃度高于對照組(P<0.05)，但卻明顯低于H+GdCl3組(P<0.05)，而缺氧和GdCl3的作用可被PI3K抑制劑LY294002所抑制(P<0.05)，NPS2143則與GdCl3作用相反。

Fig 4 Level of MMP-2 in A549 and A549/DDP cell cultured

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

2.5 不同處理因素對細胞侵襲的影響Transwell結果顯示(Fig 5)，在A549及A549/DDP細胞，與對照組比較，H組平均每個高倍(400倍)視野穿過濾膜的細胞數明顯增加(P<0.05)，提示缺氧可明顯增加A549細胞的運動侵襲能力。缺氧基礎上NPS2143能抑制A549細胞侵襲，GdCl3能促進其侵襲(P<0.05)，但這種促進作用可被LY294002阻斷(P<0.05)。

2.6 不同處理因素對細胞遷移能力的影響如Fig 6所示，在A549細胞H組較對照組遷移距離增加(P<0.05)；與H組比較，NPS2143抑制細胞遷移(P<0.05)，GdCl3能促進A549細胞的遷移(P<0.05)，而PI3K抑制劑LY294002則可抑制GdCl3的作用(P<0.05)，A549/DDP細胞遷移的變化趨勢與A549細胞一致。

3 討論

侵襲和轉移是臨床上惡性腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因，因此，揭示惡性腫瘤轉移的機制，將有助于判斷患者預后和選擇合理、有效的治療方案, 延長患者的生存期限及提高生活質量。目前，我國已為世界第一肺癌大國，因此肺癌的診療已成為我國臨床工作者面臨的嚴峻挑戰。鈣離子作為細胞內重要的信息分子，可以激活不同的信號通路，參

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

與許多重要生命活動的調節。惡性腫瘤發生、發展過程常伴隨鈣離子信號的異常，但其發生機制不甚清楚。因此，認識鈣信號在肺癌發生、發展中的作用，對于進一步揭示肺癌發生的分子機制，改善患者預后，提高其生存質量有重要意義。

CaSR是G蛋白偶聯受體C家族成員之一。Brown等[2]于1993年首先從牛的甲狀旁腺中克隆出CaSR。CaSR在維持全身鈣的平衡系統中具有重要作用，此外，還可參與細胞增殖、分化、分泌、趨化、凋亡、基因表達、離子通道開關、維持膜電位、衰老等過程。大量研究表明，CaSR在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用。CaSR是影響乳腺癌預后的獨立風險因子[11-12]。本課題組前期研究發現，CaSR蛋白在非小細胞肺癌組織中表達增強，其表達強度與腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結轉移情況密切相關，提示在非小細胞肺癌中CaSR的表達或活化可能與腫瘤細胞的增殖及侵襲、轉移相關[3]。但其具體發生機制如何，目前尚無相關報道。

眾所周知，實質性腫瘤細胞物理微環境的基本特征之一是缺氧，缺氧可活化多種細胞膜上的CaSR[13]。研究中，我們觀察到缺氧能夠上調A549及A549/DDP細胞CaSR蛋白的表達，在此基礎上，GdCl3能夠進一步加強CaSR的表達，而CaSR抑制劑NPS2143能減弱CaSR的表達，說明缺氧能夠活化A549及A549/DDP細胞的CaSR。

Brennan等[14]研究表明，激活的CaSR能夠促進乳腺癌及前列腺癌骨轉移的發生。新近研究揭示，CaSR在體內和體外促進腎細胞癌的骨轉移進程[15]。本研究結果顯示，缺氧促進A549及A549/DDP細胞遷移距離，增加穿過濾膜細胞數量和侵襲能力。上述這些作用能夠被CaSR激動劑GdCl3所增強，被CaSR激動劑NPS2143所抑制，提示缺氧活化的CaSR可能參與了A549及A549/DDP細胞的遷移和侵襲過程。

基底膜或細胞外基質的降解是腫瘤浸潤轉移的重要環節，MMP-2和MMP-9能有效降解基底膜或細胞外基質，在腫瘤的浸潤和轉移灶的形成過程中起重要作用。本研究顯示，缺氧組A549及A549/DDP細胞MMP-2蛋白表達增多，同時分泌到培養液中的MMP-2蛋白濃度增加，GdCl3能上調缺氧的這種效應，NPS2143作用相反。說明缺氧活化的CaSR可能通過促進A549及A549/DDP細胞MMP-2蛋白的表達，進而促進A549及A549/DDP細胞的侵襲和轉移的進程。

PI3K/Akt通路是腫瘤細胞侵襲轉移的經典信號途徑之一，為進一步探索PI3K/Akt通路在缺氧活化CaSR促進A549細胞侵襲的作用，我們選用了PI3K信號通路的抑制劑LY294002進行實驗。結果顯示，LY294002能夠減弱GdCl3所引起的細胞侵襲效應，表現為細胞遷移距離減少，穿過濾膜細胞的數量減少；蛋白檢測結果顯示，缺氧能夠增加Akt蛋白磷酸化水平，GdCl3能增強缺氧的作用，但該作用被LY294002所減弱。這些結果均提示，PI3K/Akt信號通路在缺氧活化CaSR促進A549及A549/DDP細胞侵襲中起重要作用。

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH group;△P<0.05vsH+GdCl3group

(致謝：本實驗在齊齊哈爾醫學院基礎醫學院分子生物學實驗室完成，感謝課題組成員的支持和協助。)