RIP140與TNF-α對心肌細胞能量代謝的調控作用

張鑾坤，陳艷芳，劉培慶

(1.中山大學腫瘤防治中心藥學部，華南腫瘤學國家重點實驗室，腫瘤醫學協同創新中心，廣東 廣州 510060；2.廣州醫學大學附屬第二醫院藥學部，廣東 廣州 510260；3.中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)是衰竭心臟重要的炎癥誘導因子，其可以激活NF-κB通路，并進一步誘導TNF-α、白介素2(interleukin 2, IL-2)等炎癥因子的產生，形成正反饋惡性循環通路。受體相互作用蛋白140(receptor interacting protein 140，RIP140)與過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)是轉錄調控輔助因子，在心臟中通過調控線粒體能量代謝途徑的關鍵基因和關鍵酶的表達，調節心肌細胞能量代謝平衡。研究表明，心臟中的代謝紊亂狀況與長時間低水平的炎癥反應息息相關。高脂飲食的小鼠顯示出心肌胰島素抵抗，并與心臟炎癥、肥厚、纖維化及收縮功能障礙有關[1]。我們前期的研究表明，大鼠心臟組織中特異性過表達RIP140可激活NF-κB通路，并促進促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-2的釋放[2]。Schilling等[3]發現，Toll樣受體介導的炎癥反應通過抑制PGC-1α，調控心臟能量代謝。Palomer等[4]發現，TNF-α可降低PGC-1α的表達，促進心肌細胞葡萄糖氧化。鑒于RIP140與PGC-1α共定位于細胞核內，并有共同轉錄輔助調控的靶基因，起著相反作用，那么TNF-α能否促進RIP140的表達，持續擴大炎癥反應與能量代謝紊亂呢？本文通過研究RIP140與TNF-α對心肌細胞的影響，探索心肌細胞中炎癥反應與代謝紊亂之間的交互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 大鼠心肌細胞H9c2，購自上海中國科學院細胞庫。

1.1.2試劑 RNA逆轉錄試劑盒、Flash SYBR Green qPCR試劑盒(Thermo)；核蛋白提取試劑盒(Active Motif)；TNF-α(Sigma)；p65、IκB-α抗體(Cell Signaling Technology)；Histone H3、α-tubulin抗體(Sigma)；RIP140(Abcam)；TRIzol(TaKaRa)；引物由上海生工合成。

1.1.3儀器 酶標儀、電泳儀、電轉儀、iQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；Image Quantity LAS4000化學發光成像儀(通用醫療)；核酸蛋白微量定量儀NanoDrop 2000、PCR儀(Eppendorf)。

1.2 H9c2細胞培養從液氮罐中取出冷凍的H9c2細胞，直接置于37 ℃融化復蘇，無菌環境下轉移至含3～4 mL DMEM培養基(含10% FBS)的15 mL離心管中，1 000 r·min-1離心6 min，棄上清，每管用5～6 mL含10% FBS的DMEM培養基重懸，接種于25 cm2培養瓶內，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。傳代3次后，取對數期細胞進行后續實驗研究。

1.3 腺病毒感染H9c2細胞攜帶RIP140基因的腺病毒(Ad-RIP140)及腺病毒空載對照(Ad-GFP)由本課題組構建，嚴格按照Clontech 腺病毒純化試劑盒(Adeno-XTM Maxi purification kit)的要求操作，其構建和鑒定參考前期研究[5]。H9c2心肌細胞分別加入重組腺病毒Ad-RIP140及對照Ad-GFP，直接覆蓋心肌細胞表面，37 ℃孵箱中培養4 h 后補加適當體積的完全培養基，繼續感染44 h。

1.4 細胞核蛋白、胞質蛋白提取與Western blot參照核蛋白提取試劑盒說明書進行，分離細胞核蛋白和胞質蛋白，考馬斯亮藍蛋白定量后，分裝50 μg蛋白上樣。配制8%的分離膠和5%的濃縮膠，70 V分離30 min，于120 V電壓繼續電泳至溴酚藍到達分離膠底部。220 mA恒流電轉90 min，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應抗體，4 ℃孵育過夜。二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，洗膜后于暗室下加入生物發光液顯影。采用化學發光成像儀、Quantity one軟件對條帶進行灰度分析，以組蛋白Histone H3、α-tubulin分別作為核蛋白與胞質蛋白的內參對照。

1.5 qPCR法檢測mRNA表達水平取各組貼壁細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，使用核酸微量定量儀對提取的RNA進行質量檢查及定量，參照逆轉錄試劑盒說明書，進行逆轉錄反應，獲得模板cDNA。使用Flash SYBR Green qPCR試劑盒對目標基因進行擴增，熒光定量PCR儀檢測熒光信號，最終以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt方法計算目標基因的mRNA相對表達水平，引物序列見Tab 1。

2 結果

2.1 腺病毒介導RIP140基因在H9c2細胞中的過表達驗證使用純化腺病毒Ad-RIP140感染H9c2細胞，Western blot檢測RIP140的蛋白表達。如Fig 1所示，隨著感染滴度的升高和感染時間的延長，H9c2心肌細胞外源性RIP140的表達逐漸增加。

Fig 1 Efficacy of Ad-RIP140

RIP140 protein level increased in H9c2 infected with Ad-RIP140 in a quantity-dependent(A) and time-dependent(B) manner.

2.2 TNF-α與RIP140引起心肌細胞能量代謝紊亂PPARs中的PPAR-α與PPAR-β/δ可調節心肌細胞脂肪酸攝取、β氧化和葡萄糖代謝的多種蛋白。丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4，PDK4)是調節丙酮酸氧化脫羧的重要激酶，控制著心肌細胞葡萄糖分解代謝的速率。為了探索TNF-α與RIP140的相互作用能否影響能量代謝，我們培養H9c2心肌細胞，分為對照組、Ad-RIP140組、TNF-α組、Ad-RIP140+TNF-α組，real-time PCR檢測PPAR-α、PPAR-β/δ、PDK4的mRNA表達水平。如Fig 2所示，與對照組相比，Ad-RIP140組PPAR-α、PPAR-β/δ、PDK4的mRNA表達水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)，TNF-α組PPAR-α和PDK4的mRNA表達水平下降(P<0.05)；與Ad-RIP140組相比，Ad-RIP140+TNF-α組PPAR-β/δ和PDK4的mRNA表達水平更低(P<0.05)。說明TNF-α與過表達RIP140可引起心肌細胞能量代謝紊亂。

Fig 2 TNF-α aggravated down-regulation of key metabolic genes by superabundant

Cardiomyocytes were infected with Ad-RIP140(MOI 240, 48h), simultaneously with or without TNF-α(100 μg·L-1, 24 h) treatment. The mRNA levels of PPAR-α, PPAR-β/δ, and PDK4 were measured.*P<0.05vsAd-GFP group.#P<0.05vsAd-RIP140 group.

2.3 過表達RIP140促進H9c2心肌細胞p65-NF-κB轉位入核我們使用純化腺病毒Ad-RIP140感染H9c2心肌細胞，觀察過表達RIP140能否在成年大鼠心肌細胞模型中激活NF-κB通路。如Fig 3所示，與腺病毒空載Ad-GFP組相比，Ad-RIP140感染組H9c2細胞核內p65含量明顯升高，胞質中IκB-α的含量下降，差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明，H9c2心肌細胞中過表達RIP140可激活NF-κB通路，p65-NF-κB轉位入核。

2.4 過表達RIP140促進H9c2心肌細胞促炎癥細胞因子mRNA表達炎癥反應中，NF-κB調控著多個誘導因子和效應因子的表達，我們利用real-time PCR技術檢測了TNF-α、IL-1β、IL-2的mRNA水平，進一步觀察炎癥通路激活后炎癥因子的表達情況。Fig 4結果顯示，H9c2心肌細胞過表達RIP140可明顯上調促炎細胞因子的表達(P<0.05)。

2.5 TNF-α增加心肌細胞RIP140的表達TNF-α可降低PGC-1α的表達，促進心肌細胞葡萄糖氧化。考慮到RIP140與PGC-1α有共同轉錄輔助調控的靶基因，TNF-α對RIP140的表達也可能有影響。我們使用TNF-α(20 μg·L-1)刺激H9c2心肌細胞12 h，觀察到RIP140的mRNA和蛋白表達均明顯升高(P<0.05)，見Fig 5。

Fig 3 Activated NF-κB signaling following RIP140

H9c2 cells were infected with adenovirus overexpressing RIP140(MOI 240, 48 h) or GFP control. Protein levels of p65 in nucleus and IκB-α in cytoplasm were detected.*P<0.05,**P<0.01vsAd-GFP group.

Fig 4 Superabundant RIP140 induced proinflammatory response in H9c2 cell

H9c2 cells were infected with an adenovirus overexpressing RIP140(MOI 240, 48 h) or GFP control. The mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-2 were measured by real-time PCR.*P<0.05vsAd-GFP group.

3 討論

心臟做功與能量代謝密切聯系，為維持其收縮與舒張功能，心肌細胞將貯存在脂肪酸與葡萄糖中的能量轉化為肌漿球蛋白的機械能。PPARs是核激素受體家族中的配體激活受體，它有3個亞型，其中PPAR-α與PPAR-β/δ在心臟的表達豐度較高，它們通過調節脂肪酸攝取、β氧化和葡萄糖代謝的多種蛋白，對心臟能量代謝起著重要的調控作用。在心肌細胞使用葡萄糖供能的代謝中，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶復合體(pyruvate dehydrogenase complex，PDC)催化下氧化脫羧，生成乙酰輔酶A。PDK4是調節PDC活性的重要激酶，控制著葡萄糖的分解代謝速率。PPAR-α、PPAR-β/δ和PDK4下調，意味著心臟利用脂肪酸供能減少，利用葡萄糖供能增多，能量供應總體降低。前期研究表明，促炎癥細胞因子與病理性心室重構和心衰的形成密切相關。心衰患者心肌組織血清中的促炎細胞因子TNF-α含量明顯增加，NF-κB活性也明顯增強。心臟特異性過表達TNF-α可引起心肌炎癥反應和病理性重構，嚴重者可導致充血性心力衰竭[6]。此外，NF-κB特異性抑制劑和基因敲除均能明顯抑制壓力負荷和AngII灌注誘導的心肌肥大[7]。轉基因小鼠心臟特異性激活IKK/NF-κB通路，可誘導炎癥性心肌病變及心衰[8]。可見，心肌肥厚、心衰的發生和發展伴隨著NF-κB通路的激活及TNF-α等促炎癥細胞因子的參與。我們前期的研究表明，特異性過表達RIP140的大鼠心臟代謝相關基因明顯下調，但三磷酸腺苷含量沒有明顯變化，心臟功能障礙得到了補償；而在梗死手術的應激下，過表達RIP140大鼠心臟在線粒體基因、呼吸控制比和ATP含量中表現出更大程度的抑制，心臟整體功能進一步惡化[9]。本研究結果中，TNF-α刺激心肌細胞導致PPAR-α、PDK4的mRNA表達水平下降，Ad-RIP140組PPAR-α、PPAR-β/δ、PDK4的mRNA表達水平下降。Ad-RIP140組、TNF-α組細胞存活率沒有變化，Ad-RIP140+TNF-α組出現細胞部分死亡的情況(約10%～15%)，存活細胞PPAR-β/δ、PDK4的mRNA表達水平更低，TNF-α應激顯然加劇了RIP140引起的心肌細胞能量代謝紊亂，與我們前期研究結果一致。

Fig 5 TNF-α induced RIP140 expression

H9c2 cells were treated with or without TNF-α(20 μg·L-1, 12 h). The mRNA(A) and protein levels(B) of RIP140 were measured by real-time PCR and Western blot.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

在心肌細胞中，LPS可通過激活NF-κB通路，誘導促炎細胞因子的產生，而抑制PPARs則加劇了此效應，說明抑制PPARs可增加NF-κB的活性[10]。我們前期的研究表明，乳鼠心肌細胞特異性過表達RIP140可通過激活NF-κB通路，使PPARs的表達明顯下降，并且PPARs的下降跟NF-κB通路激活相關[11]。可見，RIP140可誘導炎癥反應和能量代謝紊亂，本研究進一步使用H9c2成年大鼠心肌細胞模型，探索RIP140與炎癥反應之間的關系。腺病毒介導的RIP140過表達系統可激活心肌細胞NF-κB通路，致使細胞中促炎癥細胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α表達升高。綜合文獻和我們的實驗結果發現：一方面，過表達RIP140可以通過激活NF-κB通路，下調PPARs的表達；另一方面，過表達RIP140很可能通過下調PPARs的表達，間接激活NF-κB通路，從而形成炎癥與能量代謝紊亂的惡性循環。

RIP140與PGC-1α共同調節著一系列能量代謝相關的基因的轉錄，其作用相反，在心衰的發展過程中，RIP140表達升高，PGC-1α表達下降[12]。PGC-1α減少或RIP140增加，均引起PDK4的轉錄下調，導致葡萄糖的分解代謝速率加快。Palomer等[4]發現，TNF-α可降低PGC-1α的表達，抑制PDK4的轉錄，從而上調心肌細胞的糖代謝速率。這與我們給予TNF-α后，心肌細胞RIP140表達上調，且PDK4表達下降的結果是一致的。TNF-α對心肌細胞能量代謝的影響可能與RIP140表達上調有關。

綜上所述，一方面，RIP140可激活NF-κB通路，誘導心肌細胞促炎癥細胞因子白介素、TNF-α表達升高；另一方面，促炎癥因子TNF-α可刺激RIP140增加，二者作用形成一種正反饋，共同致PPAR-β/δ和PDK4表達下降加劇，加速心肌細胞能量代謝紊亂。

(致謝:本實驗在中山大學藥學院藥理毒理實驗室完成。)