ASPP2調(diào)控GRP78在L-NAME誘導胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡中的作用

謝 琳，張 輝，丁 寧，王艷華，，吳 凱，曹 軍，王青青，劉 昆，張慧萍，姜怡鄧

(寧夏醫(yī)科大學1. 基礎醫(yī)學院、2. 臨床醫(yī)學院、3. 總醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，寧夏 銀川 750004)

妊娠期高血壓疾病(hypertension disorder complicating pregnancy,HDCP)是導致孕產(chǎn)婦并發(fā)癥和圍生兒發(fā)病及死亡的常見原因，且發(fā)病機制復雜[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胎盤功能異常是造成HDCP的重要原因之一[2]。在妊娠過程中，胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡和增殖不但影響胎盤的生理功能，甚至對整個妊娠過程及結局產(chǎn)生不良影響[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被認為是細胞內(nèi)誘導細胞凋亡發(fā)生的場所[4]，持續(xù)或強烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應可能會誘導細胞發(fā)生凋亡[5]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose regulated protein 78，GRP78)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重要分子伴侶，在蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運過程及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應中都發(fā)揮著重要的作用[6]。此外，p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53， ASPP2)是p53結合蛋白家族促凋亡成員，參與細胞生長、凋亡、損傷應激等一系列的生理反應，能夠通過調(diào)節(jié)促凋亡靶基因的轉(zhuǎn)錄來促進細胞凋亡[7-8]。然而，關于ASPP2在HDCP胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡中作用機制的研究，目前尚未見報道。因此，如能闡明ASPP2調(diào)控GRP78在胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡中的作用，將為進一步研究HDCP的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司；N-硝基-L-精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)，購自Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，購自貝博公司；總RNA提取試劑盒，購自北京天根生物技術有限公司；逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒，購自Thermo Fisher公司；蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、吖啶橙/溴化乙錠染色試劑盒，購自南京凱基有限公司；caspase-12、GRP78、ASPP2抗體，均購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，購自北京中杉金橋有限公司；引物委托上海生工公司合成；ASPP2干擾腺病毒，購自上海漢恒生物科技有限公司。

1.1.2儀器 超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；電泳儀、凝膠成像儀(美國伯樂公司)；熒光定量PCR儀(上海楓嶺生物技術有限公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人胎盤滋養(yǎng)細胞株HTR-8/SVneo，購自上海瑞鹿生物技術有限公司。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達到80%時，以0 μmol·L-1L-NAME和100 μmol·L-1L-NAME干預的人胎盤滋養(yǎng)細胞分別作為對照組(Control)和L-NAME組，干預48 h后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2ASPP2干擾腺病毒感染胎盤滋養(yǎng)細胞 在光學顯微鏡下觀察，確定胎盤滋養(yǎng)細胞處于生長對數(shù)期后，棄去舊培養(yǎng)液，吸取2 mL RPMI 1640純培養(yǎng)基換液，向其中加入15 μL ASPP2干擾腺病毒液充分混勻，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)基，加入配好的培養(yǎng)液(含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3流式細胞術檢測胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡水平 用不含EDTA、不含酚紅的胰蛋白酶消化胎盤滋養(yǎng)細胞后，1 000 r·min-1離心5 min，收集細胞。用冷PBS洗滌細胞2次，1 000 r·min-1、4 ℃離心5 min收集細胞。用400 μL 1×Annexin V結合液懸浮細胞，濃度約為1×109·L-1。加入5 μL Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后，于4 ℃避光孵育15 min，然后加入10 μL PI染色液輕輕混勻，于4 ℃避光孵育5 min。使用400目的濾膜過濾后，立即用流式細胞儀檢測。以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點圖，細胞分為4個象限：左下象限為活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，左上象限為機械損傷和死亡細胞。

1.2.4吖啶橙/溴化乙錠染色檢測胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡水平 人胎盤滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)同上，待細胞進入對數(shù)生長期后，分別加入0、100 μmol·L-1L-NAME 干預細胞48 h后，收集細胞，用PBS將細胞濃度調(diào)至1×1010·L-1，取細胞懸液100 μL，加入吖啶橙/溴化乙錠染料各2 μL混勻，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。

1.2.5qRT-PCR檢測ASPP2 mRNA的表達 根據(jù)RNA提取劑盒說明書，提取人胎盤滋養(yǎng)細胞總RNA。GenBank數(shù)據(jù)庫查詢ASPP2的基因序列并設計引物：ASPP2上游引物：5′-ATTGAATCAAGAGCAGAATGCC-3′,下游引物：5′-CAGCTCATTAACACGCTTATCC-3′。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共45個循環(huán)，并以內(nèi)參GADPH為對照進行平衡，同體系擴增目的基因的相對量根據(jù)公式2-△△Ct計算,△△Ct=[CtASPP2(待測樣本)-CtGADPH(待測樣本)]-[CtASPP2(校正樣本)-CtGADPH(校正樣本)]。

1.2.6Western blot檢測caspase-12、GRP78和ASPP2的蛋白表達 按全蛋白提取試劑盒提取胎盤滋養(yǎng)細胞全蛋白，每組取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，25 V恒壓轉(zhuǎn)膜9 min，5%的脫脂奶粉封閉2 h，與抗caspase-12、GRP78和ASPP2抗體4 ℃孵育過夜，HRP標記的二抗室溫孵育2 h，于凝膠成像分析儀上成像分析，以β-actin為內(nèi)參，計算caspase-12、GRP78和ASPP2與β-actin內(nèi)參灰度值的比值，進行分析。

1.2.7免疫熒光染色檢測GRP78的蛋白表達 將細胞接種于激光共聚焦小皿中，感染ASPP2干擾腺病毒，并用100 μmol·L-1L-NAME干預48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，含有0.2% Triton X-100的PBS透化5 min，山羊血清工作液封閉1 h，然后與抗GRP78的抗體4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后，用FITC偶聯(lián)的二抗37 ℃溫育1 h，細胞核用DAPI復染，PBS洗滌后，在共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 L-NAME對胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡的影響Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，L-NAME組人胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡水平增加(P<0.05)。吖啶橙/溴化乙錠染色發(fā)現(xiàn)，對照組細胞呈現(xiàn)均勻的綠色或橙色(自然凋亡細胞)，而L-NAME組少數(shù)細胞呈現(xiàn)鮮綠色，多數(shù)細胞呈鮮亮的橙色斑點(晚期凋亡細胞)。同時Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，caspase-12蛋白表達水平與對照組相比明顯增加(P<0.05)。見Fig 1。

2.2 胎盤滋養(yǎng)細胞中GRP78和ASPP2的蛋白表達Fig 2的Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，L-NAME組GRP78和ASPP2蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

2.3 胎盤滋養(yǎng)細胞中ASPP2干擾腺病毒的感染及GRP78的蛋白表達qRT-PCR和Western blot分別檢測ASPP2、GRP78 mRNA與蛋白表達水平，F(xiàn)ig 3結果顯示，與NC組相比，shRNA1和shRNA3表達降低(P<0.01)，但shRNA3效果最明顯，后續(xù)實驗均選用shRNA3-ASPP2；干擾ASPP2后，GRP78蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。

2.4 ASPP2對胎盤滋養(yǎng)細胞中caspase-12和GRP78的影響Fig 4結果顯示，與L-NAME組相比，L-NAME+shRNA-ASPP2組caspase-12、GRP78蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。同時，免疫熒光染色也顯示GRP78蛋白表達水平降低。

Fig 1 Effect of L-NAME on apoptosis of placental trophoblast cells

Fig 2 Expression of GRP78 and ASPP2 protein

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 3 Transfection of ASPP2 interference adenovirus and protein

A:After placental trophoblast cells transfect interference control (NC group) and ASPP2 interference adenoviral fragment (shRNA1,shRNA2,shRNA3),qRT-PCR was used to detect ASPP2 mRNA expression; B:Western blot was used to detect GRP78 protein expression after interference with ASPP2 expression.**P<0.01vsNC group.

Fig 4 Effect of ASPP2 on caspase-12 and GRP78

3 討論

HDCP是產(chǎn)科常見的一種并發(fā)癥，在孕產(chǎn)婦中發(fā)病機率較高，嚴重時甚至會導致孕產(chǎn)婦、胎兒或新生兒死亡[9]。目前，對于HDCP的發(fā)病機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)[10]，多數(shù)病例在妊娠20周以后會出現(xiàn)一過性高血壓、蛋白尿等癥狀，但這些癥狀會隨著分娩結束而消失，因此，母胎界面或胎盤的功能成為越來越多人的研究重點。胎盤是哺乳動物妊娠期間由胚胎的絨毛膜和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長成的母子間交換物質(zhì)的過渡性器官，可以分泌多種激素及細胞因子，而胎盤滋養(yǎng)細胞在其中發(fā)揮著重要的功能，因此，胎盤滋養(yǎng)細胞功能的異常與HDCP密切相關[11]。同時，隨著有關凋亡在人體疾病發(fā)病機制方面的深入研究，近年來胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡與HDCP的關系倍受關注。有研究報道[12]，HDCP子癇前期患者血清NO表達水平明顯低于正常妊娠組，提示妊娠期間NO分泌不足可能是HDCP的重要致病因素之一。在本研究中，我們用一氧化氮合酶抑制劑L-NAME干預人胎盤滋養(yǎng)細胞，從而模擬HDCP微環(huán)境。實驗結果顯示，L-NAME干預48 h后，人胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡水平明顯增加，同時caspase-12蛋白的表達水平也明顯增加，表明胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡是導致HDCP的重要環(huán)節(jié)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應是機體對環(huán)境刺激所產(chǎn)生的自我保護反應，在各種疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用，并且與多種基因的表達調(diào)控相關，而長期刺激導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應會導致細胞調(diào)節(jié)功能失衡，進而引起細胞凋亡[13]。GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的重要分子伴侶，在蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運過程及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應中發(fā)揮重要作用，是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的敏感標記物[14]。本研究結果顯示，L-NAME干預胎盤滋養(yǎng)細胞后，GRP78蛋白的表達水平明顯增加，表明L-NAME誘導胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡過程中確實存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。ASPP2是ASPP細胞凋亡調(diào)節(jié)家族中結構最完整的家族成員，作為p53結合蛋白家族的一個促凋亡成員，可以通過將p53引導至促凋亡基因的啟動子而與其結合，并增強p53的凋亡能力。有研究報道[15]，ASPP2可以通過p53非依賴的形式增強DRAM和Bax的表達，進一步促進腫瘤細胞的凋亡。但是有關ASPP2在胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡方面的研究還未見報道。本實驗結果顯示，L-NAME干預胎盤滋養(yǎng)細胞后，ASPP2蛋白的表達水平明顯增加，表明ASPP2可能參與胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡的過程。那么，ASPP2是否通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，從而影響胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡呢？研究發(fā)現(xiàn)，感染ASPP2干擾腺病毒后，GRP78蛋白的表達水平明顯降低，同時用L-NAME干預胎盤滋養(yǎng)細胞后，caspase-12和GRP78蛋白的表達水平也明顯降低，提示通過下調(diào)ASPP2降低GRP78的表達，可以抑制L-NAME誘導的胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡，進一步表明ASPP2可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應參與了胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡的調(diào)控。

HDCP的發(fā)病機制復雜，并受多種復雜而精細的調(diào)控。本實驗發(fā)現(xiàn)，ASPP2可能參與胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡的發(fā)生過程，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應作為外源性引發(fā)胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡的重要靶點，在HDCP的發(fā)生發(fā)展中應該被重點關注，這可能為進一步研究HDCP的發(fā)病機制指明了新的方向。

(致謝：本實驗在寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室完成，感謝各位老師、同學在實驗過程中給予的支持與幫助。)