線粒體相關內質網膜在缺血性腦卒中的作用

王蓉蓉，王守寶，杜冠華

(北京市“藥物靶點研究與新藥篩選”重點實驗室，中國醫學科學院&北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050)

腦卒中是一種高發病率、高致殘率、高致死率疾病。根據2017年《Circulation》最新發表的中國腦卒中流行病學資料顯示，中國腦卒中年齡標準化患病率、發病率和死亡率分別為每10萬人1114.8、246.8和114.8。中國因腦卒中導致的家庭和社會負擔在過去30年中明顯增加，尤其在農村地區，并具有持續增加趨勢[1]。我國目前腦卒中防控形勢嚴峻。腦卒中臨床上分為缺血性腦卒中、出血性腦卒中和短暫性腦缺血，其中缺血性腦卒中占比87%，是腦卒中主要類型[2]。

缺血性腦卒中治療核心是及時通過藥物以及手術恢復缺血區域血流再灌注。再灌注雖然有助于挽救半暗帶瀕死細胞，但會觸發一系列繼發反應，加重缺血腦組織損傷。顯然，最終的腦組織損傷程度取決于缺血本身損傷與再灌注損傷兩方面的綜合作用。目前，臨床上尚缺乏理想的治療缺血性腦卒中藥物，唯一被FDA批準的治療急性缺血性腦卒中的藥物僅有重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant tissue-type plasminogen activator，rt-PA)。更值得注意的是，抗缺血性腦卒中藥物的研發屢屢受挫[3]。總之，缺血性腦卒中已經成為國人主要致死因素，尚缺乏合理防控措施與治療藥物，深入了解缺血性腦卒中病理生理機制，對開發相關藥物具有重要意義。

線粒體相關內質網膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes，MAM)是介導內質網(endoplasmic reticulum，ER)與線粒體之間緊密連接的特殊結構域，構成ER和線粒體細胞器之間的通訊物理基礎。大量的證據表明，線粒體與ER通過MAM直接通訊，以調控Ca2+穩態、氧化應激、炎癥反應、線粒體形態功能、脂質代謝、細胞凋亡、自噬等基本細胞過程[4]。從缺血性腦卒中的病理生理機制來看，MAM介入該病發生發展的多個環節，如線粒體功能障礙、Ca2+超載、氧化應激、炎癥、細胞凋亡等。目前，雖然直接證明MAM在缺血性腦卒中損傷過程中扮演重要角色的文獻相對較少，但是有關MAM相關蛋白參與缺血性腦卒中病理生理過程的研究卻屢見不鮮。本文就MAM作為抗缺血性腦卒中潛在靶點的可能性做一綜述。

1 MAM是線粒體與內質網互作平臺

內質網和線粒體之間的關聯，亦稱為線粒體-內質網接觸(mitochondrial endoplasmic reticulum contact，MERC)，是最先被發現的細胞器間接觸。MAM被認為是ER膜與線粒體外膜之間相互靠近形成的特化區域。通過“募集”多種蛋白，如電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channels，VDACs)、1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-triphosphate receptor，IP3R)、葡萄糖調節蛋白75(glucose regulated protein，GRP75)、囊泡相關膜蛋白相關蛋白B(vesicle-associated membrane protein-associated protein B，VAPB)、線粒體融合蛋白1/2(mitofusin1/2，Mfn1/2)等，構成細胞器之間相互通訊的物理平臺，以實現ER與線粒體功能的正常維持與相互協作，這對保證細胞生命活動至關重要。

研究表明，MAM介導的線粒體-內質網連接是動態可逆的，涉及多種蛋白的“募集”與“解聚”，并且MAM的形成面積與其連接的線粒體-內質網膜間距會隨著細胞狀態不同在5%～20%、10～30 nm的范圍波動。然而，MAM的組成蛋白卻在不同物種(人和小鼠96.56 %)之間，在不同組織(睪丸和大腦70.98%)之間高度保守[5]。目前幾個科研小組已經提出MAM中基于功能的詳細的蛋白質列表。由于研究對象與研究方法不同，MAM蛋白數量有稍許變化[5]。總體來說，MAM蛋白分為以下3類：(1)僅存在于MAM中的蛋白，“MAM專有蛋白”；通常被作為MAM標記蛋白，如乙酰輔A乙酰轉移酶1(acetyl-CoA acetyltransferase 1，ACAT1)、BiP/GRP78、鈣聯蛋白(calnexin)、鈣網蛋白(calreticulin)、Erlin-1、Erlin-2、VDACs。(2)主要存在于MAM中，同時在其他細胞器中也有分布的蛋白，“MAM富集蛋白”，如高爾基體、溶酶體蛋白。(3)暫存于MAM中的蛋白，“MAM關聯蛋白”。多種報道所得結論一致，MAM相關蛋白參與能量代謝、脂質合成、Ca2+穩態調節、線粒體功能維持，并且參與上述相關過程的蛋白大多屬于“MAM專有蛋白”[6]。另外，MAM中的一些蛋白具有多種功能，參與不同細胞過程。例如Bip/GRP78既是蛋白分子伴侶，同時也可以與IP3R結合，調節Ca2+從MAM到線粒體的轉運。總之，MAM蛋白組成具有復雜性、多功能性以及動態性，這為MAM參與多種病理過程創造了條件。

目前，內質網膜與線粒體外膜相互靠近形成MAM的機制尚不清楚。在哺乳動物中，研究者們發現了4種可能介導MAM形成的蛋白錨定復合物。(1)GRP75將ER膜上IP3R和線粒體外膜VDAC連接構成的錨定復合物。(2)ER膜上Mfn2與線粒體外膜上Mfn1/2錨定復合物，但是有來自3個不同實驗室的研究顯示，Mfn2的丟失反而導致MAM形成面積增加，這一發現使研究者對其作為錨定復合物的“身份”產生質疑[7]。(3)ER膜上VAPB與線粒體外膜上蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51(protein tyrosine phosphatase interacting protein 51，PTPIP51)錨定復合物，VAPB和PTPIP51之間的生物化學相互作用已被獨立驗證。(4)ER上B細胞受體相關蛋白31(B-cell receptor-associated protein 31，Bap31)與線粒體裂變蛋白Fission1同系物(Fission 1 homologue，Fis1)錨定復合物。另外，磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分選蛋白2(phosphofurin acidic cluster sorting protein 2,，PACS2)和Bap31復合物與MAM形成相關，但是該復合物是錨定復合物還是錨定調節因子，還需要進一步的研究驗證。錨定復合物將線粒體和ER限制在合適的距離，以便發揮MAM功能[6]。

2 MAM參與缺血性腦卒中病理進程

2.1 Ca2+穩態Ca2+穩態是細胞中多種生化反應正常進行的基礎。Ca2+信號起源于ER，主要作用于線粒體，調節多種細胞過程，是跨細胞器信息交流的主要方式[8]。線粒體在緩沖胞質Ca2+、調節分泌、維持機體穩態、細胞代謝、細胞存活、增殖、遷移和死亡等方面，起著至關重要的作用。線粒體攝取Ca2+深度依賴MAM介導的ER和線粒體緊密結合。MAM于內質網-線粒體之間形成“高鈣微區”，尤其IP3R/Grp75/VDAC構成“Ca2+高速通道”，允許線粒體通過內膜上低Ca2+親和力的Ca2+單向轉運體(mitochondrial Ca2+uniporter，MCU)迅速攝取Ca2+。在線粒體中，Ca2+信號根據其時空特性被解碼，構成促生存信號，精確調節細胞代謝。反之，Ca2+穩態失調引起Ca2+超載，Ca2+信號異常進而導致細胞凋亡。線粒體基質Ca2+高濃度長時間累積，會引起線粒體通透性轉換(mitochondrial permeability transition，MPT)。MPT引起線粒體內膜滲透性喪失，線粒體膜電位降低，ATP耗竭，線粒體外膜和細胞器破裂，最終導致細胞死亡。這種機制在病理性細胞死亡中已被廣泛研究，特別是與局部缺血和再灌注損傷有關的細胞死亡。MAM功能障礙會破壞線粒體對Ca2+的緩沖能力和細胞整體Ca2+穩態，對細胞命運產生重要影響[9]。

2.2 氧化應激在生理情況下，機體自由基生成與體內抗氧化防御系統處于動態平衡之中。各種原因導致體內自由基超出正常水平則會引起氧化應激。線粒體是產生自由基的主要場所。與線粒體相比，ER在自由基產生方面研究較少，部分原因是由于測定方法的限制。在ER中，來自細胞色素P450家族的蛋白質，NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，Nox4)和內質網氧化還原蛋白(ER oxidoreductin 1，Ero1)都是被廣泛認可的自由基產生蛋白。MAM由于是介導線粒體與ER信息傳遞的動態結構，所以非常有可能在調節自由基生成方面發揮作用。另外，研究發現，75% Ero1的異形體Ero1-α定位于MAM[10]。MAM蛋白p66SHC在氧化應激條件下被激活，并移位于線粒體活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產生部位[11]。在缺血性腦卒中病理過程中，多篇文獻報道了過量自由基在導致腦組織結構和功能損傷中的重要作用。在缺血刺激以及再灌注刺激時，細胞內產生過量自由基并長時間積累，損傷線粒體，導致功能障礙，引起細胞凋亡和壞死。

2.3 炎癥反應MAM是炎癥小體形成的關鍵位點[12]。幾年前，研究者認識到ROS可以促進激活NLRP3炎癥小體。NLRP3可以感知來自外來微生物的損傷信號、宿主的損傷信號和任何其他侵害信號，誘導炎癥反應發生。NLRP3炎癥小體一旦組裝完成，則激活白介素1β((interleukin-1β，IL-1β)和IL-18，引起炎癥反應。迄今為止，NLRP3是唯一一個被報道與MAM相關的炎癥小體[13]。NLRP3在大多數組織中表達，但主要集中于巨噬細胞中。未激活的NLRP3定位于ER膜和胞質，被激活時，NLRP3及其銜接子ASC重新定位至MAM部分，感知線粒體Ca2+、ROS[13]等信號。最近，有許多研究者關注其他炎癥小體動態定位以及激活機制，并發現內質網應激特異性上調NLRP1。所有這些數據都說明了MAM在引起炎癥反應中的重要性。然而，炎癥反應是造成缺血性腦卒中晚期損傷的典型事件，Ca2+、ROS炎癥等共同參與該病的病理生理過程。

2.4 線粒體的分裂與融合線粒體的分裂與融合是線粒體形態調控的基本方式，也是線粒體數目調控的基礎。線粒體分裂與融合的平衡對細胞存活至關重要。線粒體分裂起源于MAM。Mfn1和Mfn2在MAM高度富集，并且Mfn1和Mfn2是促使線粒體融合，保持線粒體正常形態，線粒體攝取Ca2+必不可少的要素。MAM可能是調節線粒體動力學和形態學所必需的[4]。線粒體分裂與融合狀態與線粒體功能高度統一。在缺血性腦卒中損傷早期，神經細胞線粒體分裂與融合失調導致神經細胞死亡。

2.5 脂質代謝細胞與細胞器膜上脂質對維持膜的完整性和流動性非常重要，膜脂質成分與各成分所占比重被精確控制。研究表明，MAM與脂質在內質網-線粒體之間的轉運與代謝密切相關[14]。MAM介導甘油三酯、磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)等脂質合成和轉運。磷脂酰絲氨酸合成酶(phosphatidylserine synthetase，PSS)催化磷脂酰膽堿合成磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)。經MAM轉運，PS在線粒體內膜上磷脂酰絲氨酸脫羧酶的作用下，轉化為PE。PS合成酶PSS1/2于MAM高度富集。另外，催化磷脂酰膽堿最終合成的磷脂酰乙醇胺N-甲基轉移酶2(phosphatidylethanolamine N-methyltransferase 2，PEMT2)僅于MAM發現。催化三酰甘油合成，促進脂滴形成的酰基輔酶A/二酰甘油酰基轉移酶2(diacylglycerol O-acyltransferase 2，DGAT2)位于MAM。脂肪酸輔酶A連接酶4(fatty acid-CoA ligase 4，FACL4)等脂質代謝酶作為MAM標志物。MAM富集脂質代謝酶以及介導脂質在ER和線粒體之間轉運的特性，使MAM在維持脂質正常代謝中發揮重要作用。脂質含量豐富是腦組織的生化特征之一。在缺血性腦卒中的病理過程中，細胞膜脂質在氧化應激的狀態下導致脂質過氧化，破壞細胞膜，是引起神經細胞功能障礙甚至死亡的重要因素。

2.6 細胞凋亡細胞凋亡是指機體為維持內環境穩定，觸發細胞內預存基因導致的細胞死亡過程。基于MAM對內質網-線粒體之間Ca2+信號的調節作用，MAM與細胞凋亡密切相關是意料之中的。研究表明，細胞凋亡與MAM介導的Ca2+超載密切相關，其中MAM相關蛋白VDAC在MPT現象和細胞凋亡中起到關鍵作用，VDAC的過表達會導致各種細胞類型的凋亡。MAM轉運Ca2+功能的過度激活，導致線粒體Ca2+超載，激活線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)而促進細胞凋亡[15]。MAM與細胞凋亡的關系復雜，其通過調節線粒體的融合與分裂、Ca2+穩態、ROS水平，都可以影響細胞凋亡。細胞凋亡正是缺血性腦卒中神經細胞死亡的主要類型[3]。

2.7 自噬自噬是為了維持細胞自身代謝以及更新衰老受損細胞器，通過溶酶體降解細胞器和大分子物質的過程。自噬維持細胞內穩態，也是細胞極端情況下的自我生存機制。自噬膜的起源目前沒有確證，線粒體外膜、質膜都被認為是自噬膜的起源部位。最新研究發現，MAM是自噬膜的起源部位，在自噬起始過程中起關鍵作用。在誘導細胞自噬時，自噬發生過程中的關鍵蛋白，如Atg5、Atg14、DFCP、Beclin-1、Vps15、Vps34，定位于MAM，并且在整個自噬體形成過程中定位穩定。當MAM被破壞時，Atg14標記消失，自噬小體數量減少。自噬負調節因子mTORC2激酶定位于MAM，調節MAM的完整性和線粒體活性。自噬基本過程維持，如LC3-I脂質化成LC3-Ⅱ和將calnexin募集到含有GD-3的筏狀微區，取決于MAM功能的完整性[16]。另外，在酵母中，當內質網-線粒體偶聯結構(ER-mitochondria encounter structure，ERMES)缺陷時，線粒體自噬會急劇降低。這些研究結果都說明了MAM招募自噬相關蛋白并啟動自噬的重要功能。同時，自噬是缺血性腦卒中神經細胞死亡的又一類型。

3 缺血性腦卒中的潛在治療靶點—MAM

在過去的幾十年研究中，研究者發現多種機制參與缺血性腦卒中的不可逆損傷。興奮性毒性與鈣超載是引起早期階段細胞死亡的主要因素。其中，興奮性毒性主要導致缺血性細胞內鈣超載，通過線粒體途徑引起細胞凋亡。同時鈣超載可同時引起氧化應激，作為觸發細胞死亡的額外機制。氧化和亞硝化應激也是損傷的強有力推動者。炎癥反應在局部缺血發生的幾個小時內發生，是缺血性腦卒中晚期損傷的典型事件。在溫和損傷的條件下，也就是研究者關注的半暗帶，凋亡機制占主要部分。總之缺血性腦卒中是一種多因素、多機制的復雜疾病[3]。

有趣的是，MAM介導的生物學功能與缺血性腦卒中病理生理機制存在高度重疊。研究發現，通過干預MAM錨定蛋白復合物VDAC/IP3R/GRP75對Ca2+的轉運，抑制Ca2+超載，進而抑制mPTP的開放和線粒體內的細胞色素C釋放，保護半暗帶損傷神經細胞[15]；MAM蛋白Mfn2通過線粒體途徑，改善缺氧誘導的神經細胞凋亡，延長缺血性腦卒中治療時間窗[17]；在小鼠大腦中動脈閉塞模型中，缺血后沉默MAM相關蛋白p66Shc，可保護血腦屏障完整性，減小梗死面積，改善神經功能缺損，提高小鼠存活率[18]；MAM蛋白FUNDC1、calnexin、DRP1協同作用，抑制缺氧神經細胞線粒體裂變和線粒體自噬的發生[19]；多種MAM相關蛋白參與mPTP組成，并可能直接調節其開放和關閉[20]，而mPTP開放是缺血/再灌注期間神經細胞死亡的重要標志。

另一方面，多種具有明確抗腦卒中作用的藥物或化合物，被證實通過MAM相關蛋白發揮作用。胡黃連苷Ⅱ通過下調VDAC1的表達，降低mPTP的通透性以及抑制凋亡[21]，減輕腦缺血/再灌注損傷[22]；青藤堿抑制NLRP3炎癥小體激活，發揮抗缺血性腦卒中的神經保護作用[23]；多不飽和脂肪酸可以通過影響MAM蛋白PSS1，減少新生兒缺氧缺血性腦損傷[24]；2-甲硫腺苷5'二磷酸通過IP3R調節Ca2+穩態，減少并部分逆轉缺血性腦卒中神經元損傷，并且小鼠敲除IP3R后，化合物保護作用消失甚至損傷加重，這表明IP3R-Ca2+信號通路是發揮神經保護的關鍵組分[25]。

綜上所述，MAM可以從多個環節、多個方面參與缺血性腦卒中病理過程，這為MAM作為治療缺血性腦卒中的潛在靶點提供了可靠依據。

Fig 1 MAM as a potential target for ischemic stroke

4 展望

ER和線粒體都是執行多種細胞功能的細胞器,它們之間信號轉導和功能協調影響整個細胞生命過程。MAM作為內質網-線粒體通訊的“偶聯”平臺，可以通過整合Ca2+穩態、氧化應激、炎癥、線粒體形態功能調控、脂質代謝、細胞凋亡、自噬等多種途徑，影響線粒體和ER的形態功能，進而決定細胞命運。如前文所述，從機制分析，MAM功能與缺血性腦卒中病理生理機制存在高度重疊。另一方面，多種已知具有抗腦卒中作用的藥物或者化合物，如胡黃連苷Ⅱ、2-甲硫腺苷5'二磷酸、青藤堿、多不飽和脂肪酸，都通過調控MAM相關蛋白發揮作用，這都提示我們MAM具有作為治療缺血性腦卒中治療靶點的巨大潛力。要明確MAM與缺血性腦卒中的關系，研究者首先需要驗證缺血性腦卒中患者的MAM水平是否異常，比如MAM形成面積增加或者線粒體-內質網膜間距變小。研究MAM面臨的一大難題便是如何對MAM的變化進行全方位量化評價。MAM組成的復雜性、功能的多樣性以及動態性，決定了量化MAM水平變化的困難性。研究者需要抽絲剝繭，分清主次，找出關鍵指征，為臨床應用做鋪墊。總之，MAM仍有許多問題有待闡明，研究MAM對探尋缺血性腦卒中等復雜性疾病的治療靶點具有重要意義。