Epac信號分子在纖維化疾病中作用的研究進展

杜佳佳，孫嫵弋，彭文婷，孫家昌，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協同創新中心，安徽 合肥 230032)

cAMP激活的交換蛋白分子(exchange protein activated by cAMP, Epac)是cAMP的直接靶向蛋白，通過激活Ras樣小GTP酶Rap，參與cAMP介導的信號傳導[1]。cAMP是細胞內第二信使，其在細胞應對不同刺激時起重要作用，同時也可介導免疫疾病、心臟功能障礙、癌癥、纖維化[2]等疾病相關的信號通路，因此，Epac可通過cAMP信號傳導而參與一系列疾病的病理過程。纖維化疾病是一類臨床常見疾病，是細胞外基質(extracellular matrix, ECM)過度沉積的結果，作為正常生理學的一部分或受傷后發生，例如不同致病因素的反復或持續刺激，最終導致包括心臟、肺、腎、肝臟等組織中的瘢痕形成，嚴重的導致器官功能喪失[3]。因此，深入探討纖維化疾病的病理機制，尋找纖維化疾病的治療方法顯得尤為重要。近年來，已有研究表明，Epac和纖維化疾病之間存在緊密聯系。因此，本文對Epac在纖維化疾病中的作用進行綜述，為深入了解Epac在纖維化疾病中相關作用機制，以及尋找靶點促進藥物的研究與開發提供參考。

1 Epac的結構和分型

以往研究表明，cAMP只通過激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)來發揮效應。PKA是cAMP依賴性蛋白激酶，其被cAMP激活后，通過磷酸化底物蛋白而發揮作用。1998年，De等[4]為了尋找包含cAMP結合域的蛋白，以證明存在cAMP不依賴于PKA的方式介導下游信號的激活，克隆了編碼鳥嘌呤核苷酸交換因子的基因，將其命名為Epac。由此，這種由cAMP直接調控的鳥嘌呤核苷酸交換因子進入了公眾的視野，引起研究者的廣泛探討和研究。同年，Kawasaki等[5]鑒定出Epac存在兩種亞型，分別為Epac1和Epac2。

Epac1由人類Rapgef3基因編碼，分子質量約100 ku，Rapgef3 mRNA廣泛表達于成熟組織中，如心臟、腎臟、血管、脂肪組織、中樞神經組織、子宮、肝臟等，且幾乎所有組織以及造血細胞中都發現有Epac1的表達，其在不同組織中表達高低有不同。Epac2由人類基因Rapgef4編碼，分子質量約115 ku，Rapgef4 mRNA表達相對受限[1]。Epac2有3個亞型，分別是Epac2A、Epac2B、Epac2C。

Epac由N端調控區域和C端催化區域組成(Fig 1)。Epac1和Epac2兩種亞型在催化區無明顯區別，主要由3個結構域組成，分別是Ras交換基序結構域(Ras exchange motif, REM)、Ras結合域(Ras association, RA)以及促進GTP在Rap上進行GDP交換的CDC25同源域(CDC25-homology domain, CDC25HD)。兩種亞型在N端調控區不同，如Epac2A包含兩個cAMP結合域，cAMP-A和cAMP-B，而Epac1只有1個這樣的結構域，但同時具有Disheveled/Egl-10/pleckstrin(DEP)結構域，其作用與Epac的亞細胞定位有關。EPAC2A是最初鑒定的Epac2亞型[5]，主要表達于大腦(大腦皮層、海馬體、小腦和下丘腦)、垂體和內分泌胰腺。與Epac2A相比，Epac2B缺少cAMP-A結構域，其在腎上腺、睪丸間質細胞和胰腺內分泌部有表達。Epac2C是三種亞型中最短的一個，其缺少cAMP-A結構域和DEP結構域，幾乎只在肝臟中表達[6]。

Fig 1 Domain structures of Epac proteins

2 Epac的激活及信號通路

2.1 Epac的激活ATP經腺苷酸環化酶(adenylate cyclase, AC)催化后形成cAMP，在缺少cAMP的情況下，Epac的活性由于其調控區和催化區內分子相互作用而受到抑制，從而阻止了下游效應物Rap與CDC25結構域的結合，使Rap無法被激活。在存在cAMP的情況下，cAMP與Epac結合，誘導蛋白構象發生改變，解除交換因子蛋白N末端調控區域的自抑制作用，cAMP結構與cAMP-B結構相互作用，誘導了C末端的α-螺旋cAMP結合位點結構的運動，釋放C端催化結構域，使Rap與暴露出來的CDC25結構域結合，導致Rap的激活，催化GTP與GDP的交換，隨后通過GDP交換激活GTP，刺激下游信號[7](Fig 2)。

2.2 Epac介導的信號通路除了直接調節許多重要細胞過程之外，越來越多的研究證明，Epac通過參與不同信號通路(Fig 3)，影響著許多疾病的病理過程。Epac還參與一系列的細胞內信號通路，可結合下游受體蛋白，從而發揮信號轉導功能。

Fig 2 Mechanism of Epac activation

Fig 3 Epac related signaling pathway

2.2.1Epac/Rap Ras樣小GTP酶Rap1和Rap2是Epac直接下游效應蛋白，它們在組織中傳遞大部分由cAMP介導的生物學效應。cAMP存在時激活Epac，進而催化Rap上的GDP轉化為GTP。最經典的Epac/Rap1功能之一是對細胞黏附和細胞間連接的控制，如Epac1/Rap1通過調節Rac1來穩定內皮屏障的功能[8]；Epac2/Rap1信號抑制線粒體活性氧生成，并降低心律失常易感性[9]。

2.2.2Epac/PLC Epac激活磷脂酶Cε(phospholipase Cε, PLCε)，產生肌醇-1，4，5-三磷酸(inositol 1,4,5 triphosphate, IP3)。Epac通過PLCε、IP3和鈣調蛋白激酶Ⅱ(calcium calmodulin protein kinase II, CaMKII)介導的信號通路，激活CaMKII，使雷諾丁受體(ryanodine receptor, RyR)關鍵的絲氨酸殘基磷酸化，增加自發性肌質網 Ca2+釋放，從而增強心肌細胞興奮性。Epac2還可通過PLCε通路刺激胰島素分泌[10]。

2.2.3Epac/Akt 磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)和Akt是Epac的下游信號分子，Epac激活Rap1，激活后的Rap1與PI3K亞基結合并激活PI3K參與細胞活動，如通過Epac2/Rap1A/Akt途徑促進H1299肺癌細胞蛋白去乙酰化酶8的表達[11]。磷酸二酯酶抑制劑可通過PDE4/cAMP/Epac/PI3K/Akt通路激活多種途徑，減輕燒傷引起大鼠的骨骼肌蛋白溶解[12]。

2.2.4Epac/Ras/MAPK Ras可以被Epac激活，由無活性的Ras-GDP狀態轉變為Ras-GTP狀態，從而發揮作用。被Epac激活后的Ras，可激活重組人相關RAS病毒(recombinant human related Ras viral, R-Ras)，從而調節細胞相關功能。另外，激活后的Ras還可以激活Raf，Raf是Ras/Raf/MEK/MAPK途徑的一部分，該途徑是負責將細胞膜結合受體的信號傳遞到細胞內，協調細胞對各種環境因素的反應。如在下丘腦室旁核中Epac1可能通過MEK1/2通路參與完全弗氏佐劑模型所導致慢性疼痛的發展[13]。Epac依賴性ERK通路的激活可以保護心肌細胞不受細胞死亡的影響。腫瘤細胞依賴ADRB3/cAMP/Epac/JNK通路產生腦源性神經營養因子而促進腫瘤神經支配。Epac可介導cAMP激活p38 MAPK及調節小腦神經元中Ca2+依賴性K+通道。

2.2.5Epac/PKC Epac可以誘導PKCα和PKCε的激活，Epac/PKC信號在瞬時感受器電位增強而引起炎癥的過程中，起著至關重要的作用。另有研究表明，β-腎上腺素受體激動劑可激活cAMP/Epac/PKCδ/p38 MAPK通路，在新生小鼠心臟成纖維細胞中產生IL-6，該研究確認了Epac是cAMP與p38 MAPK信號通路之間的連接，并證明PKCδ可以作為cAMP/Epac通路的一種新的下游效應蛋白[14]。

2.2.6Epac/C/EBP-β CCAAT/增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-β, C/EBP)是DNA結合轉錄因子bHLH基因家族的成員。Epac可以通過影響C/EBP-β在腎小管上皮細胞線粒體生物合成而發揮重要作用，激活cAMP/Epac/C/EBP-β通路可以改善慢性腎病[15]。另外，Epac信號還可以激活C/EBP-β或C/EBP-δ，上調蛻膜催乳素的 mRNA在人類胚胎干細胞中表達。

3 Epac與纖維化疾病

3.1 心肌纖維化心臟在高血壓或心肌梗死等疾病損傷后，體內多種介質如血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)、內皮素1(endothelin 1, ET-1)和轉化生長因子 β(transforming growth factor β, TGF-β)會促進心臟成纖維細胞的活化，從而導致成纖維細胞增殖、遷移，ECM過度生成，且使成纖維細胞分化形成肌成纖維細胞，形成的肌成纖維細胞組織結構重塑導致纖維瘢痕的形成，引起一系列的心臟功能受損。腺苷是由腺嘌呤核苷酸經直接刺激、缺氧或損傷而從細胞外產生的一種小分子，通過經典的G蛋白偶聯受體作用，導致cAMP的產生和下游靶點的激活。Phosri等[16]使用從新生SD大鼠心室分離培養的心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts, CF)，證實了用腺苷A2受體刺激劑(CV1808)刺激后，其通過cAMP依賴性途徑抑制膠原合成，并抑制Ang Ⅱ誘導的心臟肌成纖維細胞(cardiac myofibroblasts, CMF)分化，從而產生抗纖維化作用。當使用PKA抑制劑(PKI)阻斷PKA活性時，腺苷A2受體介導的抑制Ang Ⅱ誘導的膠原合成和α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表達的作用不受影響，而當用Epac特異性抑制劑(ESI-09)阻斷Epac活性時，則明顯拮抗腺苷A2受體的抗纖維化作用，提示Epac在A2受體介導的抑制Ang Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞膠原生成中是必需的，Epac在此模型下可協同腺苷A2受體產生抗纖維化作用。

但是，Epac1在心肌纖維化中的作用存在相互矛盾的現象，如另有研究表明，Epac1有促進纖維化進程的作用。Cai等[17]選用5型腺苷酸環化酶(AC5)高表達基因小鼠(AC5TG)、Epac1敲除小鼠、AC5TG-Epac1敲除小鼠(AC5TG與Epac1敲除小鼠交配而產生的小鼠)、野生型小鼠，經微型滲透泵連續7 d給予異丙腎上腺素，心臟Masson染色結果顯示，AC5TG小鼠心臟的心肌纖維化程度明顯大于野生型小鼠，提示AC5過表達加劇了異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化，在AC5TG-Epac1敲除小鼠模型中未觀察到這種惡化。此實驗結果表明，敲除Epac1可以減輕AC5介導的兒茶酚胺應激誘導的心肌纖維化。Ivonne等[18]分離新生大鼠的心室成纖維細胞，培養分化成為CF、CMF。與CF相比CMF可分泌更多的ECM蛋白。使用TGF-β刺激后，結果顯示CMF中的Epac1水平高于CF。與CMF相比，CF具有較低的Epac1和α-SMA表達水平，Epac1蛋白含量的增加可能是CMF在心臟創傷愈合過程中完成細胞功能所必需的，如膠原的分泌、ECM的黏附和收縮等。以上實驗結論不同可能是由于刺激方法不同，Epac1在不同條件下表達的不同還需大量實驗來加以研究。

3.2 腎纖維化腎纖維化最初表現為血管生成異常、毛細血管閉塞、周細胞和血管周圍細胞的刺激，隨后通過產生促炎細胞因子，進一步刺激腎臟系膜細胞、成纖維細胞和腎小管上皮細胞，在間質間隙產生和沉積大量的ECM成分。在這些細胞類型中，腎小管上皮細胞被認為是ECM沉積的主要來源之一。Ding等[19]選用♂CD-1小鼠，通過尾靜脈注射給予Epac1激動劑8-pCPT-2′-O-Me-cAMP(8-O-cAMP)，于單側輸尿管梗阻手術前1天尾靜脈注射，連續給藥7 d。與只做單側輸尿管梗阻手術組小鼠以及用鹽水處理組小鼠比較，用Epac1激動劑進行預處理的小鼠纖維連接蛋白表達明顯減少，而單側輸尿管梗阻手術組和生理鹽水組小鼠纖維連接蛋白表達均明顯增加。細胞水平上，用不同劑量的8-O-cAMP對原代腎小管上皮細胞預處理30 min，再用TGF-β1處理48 h，結果表明，經Epac1激動劑處理后，激活的Epac1可以降低TGF-β1誘導的纖維連接蛋白的表達，同時減少腎小管萎縮、腎小管細胞脫離和間質纖維化。此實驗結果提示，Epac1是腎纖維化中腎小管上皮細胞中cAMP信號轉導不可或缺的效應物，激活Epac1可減輕腎纖維化的程度。

3.3 肝纖維化肝纖維化是機體對慢性損傷如病毒感染、藥物誘導、代謝紊亂、脂肪性肝炎的修復反應，當肝受損時，肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)受多種信號通路調節，經歷了以α-SMA表達、ECM沉積為特征的肌成纖維細胞表型的活化過程，肌成纖維細胞是造成肝纖維化ECM形成的主要來源。Yang等[20]用200 μmol·L-1乙醛處理大鼠HSC 48 h造成細胞水平的酒精性肝纖維化模型，使用定量逆轉錄聚合酶鏈反應和免疫印跡法對兩種Epac亞型的mRNA和蛋白水平進行了定量研究，結果顯示Epac1、Epac2在大鼠HSC中均有表達。乙醛誘導的HSC中，Epac2的表達明顯高于對照組，而Epac1的表達降低。這些結果提示Epac1或Epac2可能參與調節HSC的活化。沉默Epac1和同時沉默Epac1和2使乙醛刺激的HSC增殖活力上升，且α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達水平升高。因此，研究者推測Epac1相對于Epac2來說可能起到一種保護性的作用。戴志娟等[21]對SD大鼠腹腔注射二甲基亞硝胺誘導肝纖維化，結果顯示，在急性肝損傷時期，Epacl和Epac2蛋白總體表達水平均下降。之后隨著肝纖維化逐步加重，Epacl水平升高，6周時達到高峰，而Epac2水平繼續下降，4周時達到最低水平，該實驗結果提示，Epac1和肝纖維化進程呈正相關，Epac2和肝纖維化進程呈負相關。以上兩個研究者所得出結果不同的原因可能是所造模型不同，也可能由于體內實驗復雜的信號反饋和體外實驗有區別所導致，Epac在纖維化發生過程中的具體作用以及兩種亞型是否存在功能差異，還需要在不同模型之中再進行研究證明。

3.4 肺纖維化肺成纖維細胞在正常組織修復和纖維化形成過程中參與膠原的分泌，成纖維細胞分泌ECM在肺損傷后創面愈合中起重要作用，但過度積聚可導致肺纖維化。ET-1已被證明參與了人類肺纖維化，Hartopo等[22]分別采用ET-1轉化酶雜合子敲除小鼠(ECE-1+/-)及野生型小鼠(ECE-1+/+)，建立博萊霉素誘導的肺纖維化模型，在博萊霉素滴注后d 7、14、28檢測肺炎癥和纖維化。結果顯示，與未注射博來霉素的ECE-1+/-及ECE-1+/+相比，滴注博來霉素的ECE-1+/+小鼠細胞內cAMP、Epac1和PKA水平下降，而ECE-1+/-小鼠細胞內cAMP、Epac1和PKA水平不變。雖然不能排除其他誘導劑參與這一過程的可能性，但研究者認為，在ECE-1+/-小鼠中的降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)激活了cAMP/Epac1和cAMP/PKA通路。另有免疫組化結果表明，Epac1在ECE-1+/-小鼠的炎性區出現陽性表達，而在ECE-1+/+小鼠的組織中未見陽性表達。因此研究結果提示，ECE-1活性降低導致CGRP水平升高，通過激活CGPR/cAMP/Epac1信號通路，改善肺纖維化程度，提示Epac1在此肺纖維化模型中起到抑制的作用。Huang等[23]研究了Epac在細胞水平上的表達，他們采用正常和纖維化成人患者的肺成纖維細胞，蛋白免疫印跡法結果表明Epac1在這些細胞中有表達，相反，Epac2在這些細胞中無表達。進一步轉染沉默Epac1的shRNA，結果證明前列腺素E2通過激活Epac1抑制細胞增殖，并通過pull-down實驗進一步確定Rap1為Epac1抑制增殖的下游靶點。

3.5 囊性纖維化囊性纖維化(cystic fibrosis, CF)是由囊性纖維化跨膜調節因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)基因突變，引起cAMP調控的氯離子通道表達、轉運或功能受損的一種遺傳性疾病。已知Epac1是影響微管蛋白聚合的一種cAMP信號分子，微管在CF細胞信號傳遞中具有重要作用。研究者們對缺乏CFTR基因的小鼠和野生型小鼠的全肺溶解物進行了檢測，缺乏CFTR基因表達的小鼠肺中Rap1-GTP/Rap1總含量明顯低于野生型小鼠。由于Epac1是小GTP酶Rap1的激活因子，所以Rap1-GTP含量可作為Epac1激活的指標，因此研究提示Epac1在CF小鼠中表達是降低的，CF中Epac1活性降低是導致CF細胞微管蛋白聚合速率降低的機制之一，CF細胞存在Epac1/Rap1信號轉導缺陷，導致微管重構率受損，進而導致膽固醇積累[24]，提示在此模型中Epac起到抑制作用。

3.6 骨髓纖維化慢性髓細胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)是一種多能干細胞水平上的腫瘤性惡變疾病，其疾病發展過程中常伴骨髓纖維化。與正常人相比，CML患者的所有細胞均表達較高水平的多藥耐藥蛋白4(multidrug resistance protein 4, MRP4)，且MRP4被認為是cAMP介導的信號通路的獨立調節者。研究者采用M07e髓系白血病細胞，用MAPK/ERK抑制劑PD 98059預處理細胞后，可完全抑制cAMP激動劑(db-cAMP)導致的細胞活性增加，而PKA抑制劑KT5720以及作為PI3K和p38的抑制劑SB203580對細胞活性的影響無統計學意義。為進一步證實Epac/MEK通路參與調控，將Epac siRNA和對照siRNA轉染M07e細胞，隨后用db-cAMP和選擇性Epac激動劑8- CPT-Me-cAMP(8-CPT)刺激，與對照siRNA相比，Epac siRNA的預處理明顯降低了MRP4的表達。此結果表明Epac信號通路上調M07e的MRP4表達[25]，提示在骨髓纖維化中Epac也起到了一定作用。

4 展望

1998年Epac 的發現豐富了cAMP信號通路，拓寬了對于cAMP誘導的信號通路及其在生理過程中作用的理解，但是對于Epac的研究還有許多不足或未涉及的領域。纖維化疾病一直都是現代醫學治療的重點和難點，因此對于Epac相關信號通路的日益了解會為纖維化性疾病的治療提供新的方向和途徑。近來發現對于Epac的深入研究，可以利用Epac條件性基因敲除鼠，特異性敲除可以提高基因研究的靶向性，也可以提高我們對哺乳動物組織中Epac的病理生理學的了解。另外目前很多學者在研究亞型特異性的激動劑和拮抗劑，這對于深入研究亞型特異性功能具有積極的作用。由于不同亞型介導的信號通路導致的生理作用可能不同，因此不同亞型的特異性激動劑或拮抗劑在各個不同細胞及生理過程中具體起到的作用是很有必要多關注的，希望將來靶向Epac小分子也可以成為對于纖維化有效的治療方法。