Fas-FasL信號途徑在ITP患者血小板凋亡中的作用研究

周國忠 羅洪強 董燕媛

原發性免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）臨床表現為患者皮膚黏膜瘀斑、瘀點以及各種出血現象[1]。ITP為患者機體免疫功能紊亂和失衡等原因所導致的異質性自身免疫性疾病，長期用藥往往會帶來不良反應，嚴重影響患者的生活質量[2]。ITP的治療方法包括靶向性治療、免疫干預和免疫穩態重建等。ITP患者外周血中活化的淋巴細胞增多與血小板凋亡異常有重要關系。目前，臨床尚未明確ITP患者T細胞凋亡的信號傳導機制。本研究采用流式細胞術檢測ITP患者外周血調節性T細胞（Treg細胞）比率與PLT，以及血小板表面Fas的表達和T細胞表面Fas配體（FasL）的表達，探討Fas-FasL凋亡信號傳導途徑在ITP患者血小板異常凋亡中可能的作用機制，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年1月至2017年4月本院血液科門診或住院的ITP患者32例（ITP組），ITP診斷根據血液和骨髓檢查確診，符合成人ITP診斷標準[3]。另擇同期來本院行健康體檢者32例為正常對照組，排除ITP及其它自身免疫性疾病。ITP組男14例，女18例；年齡16～75歲，中位年齡34.8歲。正常對照組男13例，女19例；年齡19～68歲，中位年齡32.6歲。兩組受檢者性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 CD4－FITC、CD127－PE、CD25－PEcy5、CD8－FITC購自美國BD公司。CD41－FITC購自美國 Backman Coulter公司。Fas－PE、FasL－PE 和同型對照IgG1－FITC、IgG1－PE 購自北京Immunotech公司。溶血試劑購自美國庫爾特公司。FC500型流式細胞儀和EPICS Q－PREP溶血儀均購自美國庫爾特公司。

1.2.2 外周血T細胞與血小板的分離 采集ITP組患者（用藥治療前）與正常對照組受檢者外周靜脈血3ml，EDTA－K2抗凝。先以1 000 r/min離心全血2 min，提取富含血小板的血漿，再以3 000 r/min離心血漿5min提取血小板懸液，流式細胞儀檢測PLT，RPMI 1640培養液調整血小板濃度約2×106/ml。以FICOLL分離液分離出單個核細胞，采用溶血素溶解RBC，用10%的小牛血清RPMI 1640培養液調整細胞濃度約為2×106/ml。

1.2.3 T細胞FasL測定 取2支試管，各加入100μl單個核細胞懸液，2管分別加入CD4－FITC、FasL－PE和CD8－FITC、FasL－PE，以上各管配備相應的對照管。混勻，4℃避光 15min，PBS洗滌 1次，各管加入 600μl PBS緩沖液，上流式細胞儀檢測CD4+FasL+細胞比率、CD8+FasL+細胞比率。

1.2.4 血小板Fas測定 取2支試管，各加入100μl血小板懸液，分別加入 20μl CD41－FITC、20μl IgG1－PE 和20μl CD41－FITC、20μl Fas－PE，混勻，4℃避光 15min，PBS洗滌1次，各管加入600μl PBS緩沖液，上流式細胞儀檢測CD41+Fas+血小板比率。

1.2.5 Treg細胞檢測 取1支試管，加入100μl單個核細胞懸液，分別加入 20μl CD4－FITC、5μl CD127－PE 和10μl CD25－PEcy5，配備相應的對照管。混勻，4℃避光15min，PBS洗滌1次，各管加入600μl PBS緩沖液，上流式細胞儀檢測Treg細胞比率。

1.3 觀察指標 觀察并比較ITP組患者與正常對照組受檢者CD4+FasL+細胞比率、CD8+FasL+細胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT與Treg細胞比率，并分析ITP組患者以上5種指標的相關性。

1.4 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ITP組患者與正常對照組受檢者CD4+FasL+細胞比率、CD8+FasL+細胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT 與Treg細胞比率比較 見表1。

表1 ITP組患者與正常對照組受檢者CD4+FasL+細胞比率、CD8+FasL+細胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT與Treg細胞比率比較

由表 1可見，ITP組患者CD4+FasL+細胞比率、CD41+Fas+血小板比率均高于正常對照組受檢者（均P＜0.05），PLT與Treg細胞比率均低于正常對照組受檢者（均P＜0.05）。ITP組患者與正常對照組受檢者CD8+FasL+細胞比率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 ITP組患者CD4+FasL+細胞比率、CD8+FasL+細胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT與Treg細胞比率相關性分析 見表2。

表2 ITP組患者CD4+FasL+細胞比率、CD8+FasL+細胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT與Treg細胞比率相關性分析（相關系數r）

由表2可見，ITP組患者PLT與CD4+FasL+細胞比 率、CD41+Fas+血小板比率均呈負相關（均P＜0.05），與Treg細胞比率呈正相關（P＜0.05）。Treg細胞比率與CD41+Fas+血小板比率呈負相關（P＜0.05）。

3 討論

ITP是免疫功能紊亂造成血小板減少的出血性疾病[4-5]。本研究通過對患者淋巴細胞膜表面相關分子水平檢測，分析T淋巴細胞活化途徑介導的血小板細胞凋亡機制在ITP患者發病中的可能作用。

細胞凋亡途徑有Fas-FasL途徑、P53途徑和TNFR/TNF途徑等,而以Fas-FasL途徑介導的細胞凋亡紊亂是體液和細胞免疫失衡的主要原因[6]。Fas又稱APO-1（CD95分子），是腫瘤壞死因子受體和神經生長因子受體家族成員，是Ⅰ型細胞膜蛋白，能通過死亡域間作用并促進聚合而誘導凋亡，又稱為死亡分子。FasL是腫瘤死亡因子相關的Ⅱ型跨膜蛋白，是Fas抗原的天然配體[7]。Fas與FasL相互作用是細胞凋亡的重要途徑之一。FasL陽性的細胞毒性T細胞與表達Fas的靶細胞接觸，可誘導靶細胞程序化死亡[8]；而Fas/FasL介導的凋亡機制在ITP發生、發展中仍未完全闡明，值得深入研究。本研究采用流式細胞術檢測了ITP患者T細胞亞群FasL蛋白的表達，結果顯示T細胞各亞群FasL表達均升高。與正常對照組受檢者相比，ITP患者外周血CD4+FasL+細胞比率高，CD41+Fas+血小板比率也高。這說明高表達Fas的血小板可與活化的T細胞上FasL結合,T細胞可通過Fas－FasL途徑直接介導血小板凋亡。此外，本研究結果顯示，同樣屬于T淋巴細胞，CD4+T細胞在ITP的Fas－FasL介導的凋亡發病機制中占主要作用，CD8+T細胞作用不明顯。

Treg細胞有免疫應答低下和免疫抑制的功能，可抑制T、B細胞的活化、增殖和自身抗體的產生，在免疫性疾病發生、發展中起重要作用[9]。目前Treg細胞在ITP發病機制中的作用受到重視。Treg細胞約占外周血CD4+T細胞的5%～10%。根據不同的免疫表型，Treg細胞主要包括：CD4+CD25+Treg細胞、Tr1型CD4+Treg細胞、Th3型CD4+Treg細胞和CD8+Treg細胞等亞群[10]。本研究結果顯示，與正常對照組受檢者相比，ITP組患者外周血Treg細胞比率明顯降低；ITP組患者PLT與Treg細胞比率呈正相關。這說明ITP患者中血小板特別低的，外周Treg細胞比率明顯減少；當ITP患者處于緩解期時，Treg細胞比率會增高。因此Treg細胞比率或可作為ITP患者預測預后的指標來指導臨床治療。

綜上所述，血小板高表達Fas可與激活的T細胞表面FasL結合，T細胞可通過Fas-FasL途徑直接介導血小板凋亡。本研究結果表明，Fas、FasL表達異常在ITP患者免疫功能紊亂、T細胞亞群及血小板凋亡中起重要作用。