電針足三里對坐骨神經慢性壓迫性損傷大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表達的影響

李瑜芝 ，余文英 ，吳倩雯 ，黃 華 ，林麗莉

（1.福建中醫藥大學針灸學院，福建 福州 350122；2.澳大利亞悉尼北京同仁堂中醫診所，澳大利亞 悉尼 2000）

神經病理性疼痛是軀體感覺系統損害或疾病導致的疼痛，主要臨床表現為自發痛，不同患者疼痛性質不全相同，以牽扯樣痛、電擊樣痛、針刺樣痛、撕裂樣痛、燒灼樣痛、重壓性痛、膨脹樣痛及麻木樣痛較多見，發病機制主要在于外周敏化、中樞敏化及離子通道改變［1］。細胞外信號調節蛋白激酶（ERK1／2）為絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）的重要家族成員之一［2］，其參與多種細胞信號傳導，在疼痛性傷害性刺激引起的外周及中樞神經遞質、細胞信號傳導、離子通道等變化中發揮重要作用。研究已經表明在多種疼痛模型中脊髓背角磷酸化ERK1／2被激活，表達顯著升高，提示活化的ERK1／2可能參與疼痛的維持和痛覺的神經敏化［3-5］。針刺鎮痛歷史悠久，療效顯著，電針是在傳統針刺的基礎上加入一定參數的電流進行脈沖刺激以增強療效的現代療法，其鎮痛作用明確［6］。針刺足三里具有良好的鎮痛效果，尤其體現在神經病理性疼痛、炎性痛和癌癥痛等［7-8］。本研究旨在通過觀察電針足三里穴對慢性神經病理性疼痛大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表達的影響，探討電針足三里穴鎮痛可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠24只，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002，體質量 220～280 g，由福建中醫藥大學實驗動物中心飼養，自由進食飲水，室溫保持在（25±2）℃，光照周期 12／12 h。

1.2 實驗試劑與儀器 雙極針灸針（0.30 mm×25 mm，蘇州針灸用品有限公司）；HANS-200A韓氏穴位神經刺激儀（北京華運安特科技有限責任公司）；4-0絡制腸線（上海浦東金環醫療用品股份有限公司）；ERK1／2一抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；β-action一抗（美國 CST 公司）；HRP 鼠抗兔IgG二抗（南京諾維贊生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 熱痛閾值測定 將大鼠置于黑色布袋中，頭部在前，待測尾部露出布袋外，待動物安靜后進行熱痛閾值測量。在布套束縛限制運動的條件下，用50℃的熱水浸燙大鼠尾部中下三分之一，以其甩尾時間閾值作為測痛指標，用秒表計時。每只測試3次，每次間隔5 min，取3次平均值，測試時間為上午8～12時。所有實驗大鼠在入組前均接受熱痛閾測定，熱痛閾值小于2 s或者大于10 s者表示動物反應過敏或者遲鈍，為痛覺異常大鼠，不納入試驗對象。

2.2 分組與造模 適應性喂養1周后進行熱痛閾篩選，采用隨機數表法將SD大鼠分為空白組、模型組、電針后即刻組、電針后0.5 h組，每組各6只。模型組、電針后即刻組和電針后0.5 h組參照文獻［9］中的造模方法：手術前一天禁食不禁水，用10%水合氯醛（4 mL／kg）腹腔注射，麻醉成功后，備皮、消毒、鋪無菌巾，剪開術區皮膚約2 cm，鈍性分離肌肉，暴露右側坐骨神經中段，用4-0的鉻制腸線給予疏松單結結扎4次，1 mm間隔，松緊度以不影響坐骨神經血液循環和右后肢肌肉出現輕微抖動為標準，結扎線可以在坐骨神經主干上滑動，在切口處敷青霉素鈉鹽粉預防感染，縫合皮膚。手術后，每3只大鼠為一籠飼養，麻醉清醒后自由攝取水和食物，密切觀察生命體征和傷口愈合情況。

2.3 干預 將電針后即刻組和電針后30 min組大鼠固定于特制鼠籠中，使之頭尾稍可活動，但身體不能轉動，于造模后第7天開始進行雙側足三里穴電針治療，參照《實驗針灸學》［10］定位雙側足三里穴，約在大鼠腓骨小頭下方約5 mm處，選用雙極針配合韓式電針儀治療，參數為：疏密波，2 Hz，輸出電流1 mA。留針20 min，強度以大鼠肢體輕微顫動，但不出現掙扎為準。空白組和模型組大鼠固定于特制鼠籠，使之頭尾稍可活動，但身體不能轉動，固定20 min。

2.4 取材 空白組和模型組固定20 min后即刻取材，電針即刻組和電針后30 min組分別于電針后即刻和30 min后取材。以10%水合氯醛（4 mL／kg）腹腔麻醉，腹腔面朝上固定，打開胸腔，暴露心臟。灌注用針頭自左心室插入主動脈，固定針頭，剪開右心耳。用吊泵快速注入0.9%NaCl溶液沖洗血管，剪開大鼠背部正中線皮膚，分離脊柱兩側肌肉，暴露出胸、腰、骶段脊柱，先游離坐骨神經至椎管處，再剪開椎板暴露脊髓，用玻璃分離針挑開脊膜，最后迅速將脊髓剪下，截取脊髓腰膨大（L4～L6節段脊髓），迅速丟入液氮中，待取材完畢后轉移至-80℃冰箱備用。

2.5 觀察指標及方法

2.5.1 熱痛閾值 檢測4組大鼠造模前后及干預后熱痛閾值。

2.5.2 Western blot法檢測ERK1／2蛋白的表達提取脊髓組織總蛋白后，采用BCA蛋白定量法定量，取30 μg蛋白為上樣量進行SDS-PAGE電泳，將表達產物電轉移至聚偏氟乙烯膜上。在Western封閉液中封閉1～2 h，經TBST緩沖液清洗后分別加入一抗 ERK（1∶7 000）、β-actin（1∶1 000）孵育，4 ℃搖床過夜。TBST緩沖液清洗后加入二抗，室溫孵育1.5 h。TBST再次清洗，于超高靈敏度化學發光成像系統中成像顯影，采用Bio-Rad圖像分析軟件對條帶進行灰度值分析。

2.6 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析。計量資料符合正態分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗。

3 結 果

3.1 4組大鼠熱痛閾值比較 見表1。

表1 4組大鼠熱痛閾值比較（x±s）s

3.2 4組大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表達比較見圖1。

圖1 4組大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白表達比較

4 討 論

脊髓背角是疼痛信息傳遞和整合的初級中樞，當外周神經受到卡壓、損傷或者炎性物質刺激時，傷害性信號經神經節初步濾過后向上傳至脊髓的背角感覺神經元，從而引起痛覺［11］。神經性病理性疼痛是難治療的痛癥，目前已有較多相關研究，但在臨床上仍然相當棘手，鎮痛藥物的使用難免給患者帶來抑郁、煩躁等不適。研究表明神經性病理性疼痛動物模型中脊髓背角ERK1／2的表達顯著升高，ERK1／2活性的變化與CCI導致的痛覺過敏有關，這充分說明ERK1／2蛋白可能參與神經性病理性疼痛的發生與維持［12-14］。同時有學者通過提前給予疼痛大鼠髓內注射ERK1／2抑制劑，發現其疼痛可以大幅度地減輕［15］。本課題通過免疫印跡技術的測定也觀察到CCI模型大鼠的ERK1／2蛋白表達較空白組顯著升高。

《勝玉歌》云：“兩膝無端腫如斗，膝眼三里艾當施。”《席弘賦》亦云：“腳痛膝腫針三里。”《靈樞·四時氣》曰：“著痹不去，……率取其三里。”《針灸大成》中認為足三里能治療腰腿痛。《通玄指要賦》中亦可見“三里卻五勞之羸瘦；痹腎敗，取足陽明之上”的表述，《馬丹陽十二穴歌》云：“三里膝眼下，三寸兩筋間。能通心腹脹，……腿腫膝腔酸。”足以證明古代已經明確足三里治療腰腿疼痛的重要功效，且足三里穴深層為腓深神經，這些神經正是坐骨神經的分支部分。研究應用針刺合谷、三陰交和足三里觀察產婦鎮痛的效果，結果提示足三里穴可以很好發揮鎮痛的功效。李思思等［16］通過觀察電針“足三里”“陽陵泉”穴對坐骨神經慢性壓迫性損傷大鼠脊髓背角酪氨酸激酶B受體的影響，認為電針足三里穴可能是通過減少大鼠脊髓中 TrkB受體的表達而產生鎮痛作用。喬麗娜等［17］研究認為支配足三里穴傳入纖維的胞體主要位于L3～S1，不僅說明了針刺具有神經階段性的鎮痛，也符合現代神經解剖學和生理學理論遠節段取穴和傳統針刺遠端取穴的原則。大量現代研究表明，足三里穴具有鎮痛功效，尤其是對神經病理性疼痛和炎性痛有良好的效果，電針足三里穴可以明顯緩解神經病理性疼痛［18-20］。

針刺療法是祖國醫學的重要外治法之一，體表細胞受到針刺機械刺激后，可引起某些蛋白或酶類物質活性的改變而導致一些瞬時效應，激活和啟動其血管和神經的相關功能，以達鎮痛的目的。而電針療法是在傳統針刺療法基礎上配合相應參數的電流與脈沖的一種現代醫學療法，研究發現其鎮痛機制十分復雜，其中在外周中樞脊髓的鎮痛機制主要表現為抑制膠質細胞的活化［21］，抑制突觸的可塑性［22］，調控脊髓 NOS 的功能［23］，抑制興奮遞質的釋放［24］，調節抗炎因子和促炎因子以及P2X受體的表達［25-26］。有研究表明電針通過抑制ERK1／2蛋白的表達來緩解神經性病理性疼痛［27-28］，但是從不同針刺時間的角度研究電針對脊髓背角ERK1／2蛋白的表達情況以研究其電針鎮痛效應尚未見明確的報道。

本研究結果顯示，電針足三里0.5 h后可提高CCI大鼠熱痛閾水平，同時下調脊髓背角ERK1／2蛋白的表達，提示電針后0.5 h組通過可能抑制CCI模型大鼠ERK1／2蛋白水平的表達從而達到鎮痛作用。相反，電針后即刻組ERK1／2蛋白水平稍高于模型組，可能是由于剛剛電針完的大鼠處于一種應激的狀態而誘發了ERK1／2的活化。今后可進一步延長電針干預后時間進一步跟蹤ERK1／2的表達，以更加明確電針抑制ERK1／2蛋白水平發揮鎮痛效應，甚至進一步探討電針后效應的特點。

綜上所述，CCI模型可致大鼠脊髓背角ERK1／2蛋白的活化，使其表達增加，經電針足三里穴0.5 h后可以降低脊髓背角ERK1／2蛋白的表達水平，從而發揮鎮痛效應。