基于蛋白組學探討石斛合劑對糖尿病大鼠的作用機制

林心君，秦崇濤，陳 勇，施 紅

（福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州 350122）

糖尿病是以慢性高血糖為其主要特征的代謝性疾病，隨著其發(fā)病率的不斷增加，現(xiàn)已成為全球廣泛關(guān)注的公共健康問題。我國糖尿病患者人數(shù)全球第二，僅次于印度，其中90%以上為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）［1］。 臨床上治療 T2DM 的藥物雖各具特點和優(yōu)勢，但仍不能滿足臨床治療的需求［2-3］。中醫(yī)藥治療糖尿病在我國已有數(shù)千年的歷史，大量研究表明中藥能多組分、多靶點地發(fā)揮治療作用，糾正糖尿病患者機體穩(wěn)態(tài)失衡，有著標本兼顧的優(yōu)勢［4-6］。本課題組多年來通過對T2DM的臨床-基礎(chǔ)的反復實踐與修正，形成了具有滋陰益氣活血功效的中藥復方石斛合劑（專利申請?zhí)枺?01110408411.0）。該方不僅使患者煩渴、燥熱、乏力等癥狀明顯改善，甚至消失，具有穩(wěn)定的降糖、調(diào)脂功效，還能改善糖尿病模型鼠的糖脂代謝，促進胰島細胞增殖和胰島素受體表達，促進HepG2細胞糖代謝［7-10］。糖尿病大鼠肝組織基因表達譜芯片研究發(fā)現(xiàn)：糖尿病大鼠與正常大鼠存在的差異基因有1 300多個，經(jīng)石斛合劑治療后近千個基因表達量恢復正常［11］。而蛋白質(zhì)組學的研究是對基因組信息的進一步解讀［12］，相對和絕對定量同位素標記（isobarictags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)能高通量篩選蛋白質(zhì)，使尋找新的糖尿病藥物治療靶點逐步成為可能，在糖尿病領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［13-14］。我們在建立糖尿病大鼠模型的基礎(chǔ)上利用該技術(shù)對大鼠肝臟進行蛋白組學檢測和數(shù)據(jù)信息學分析，尋找糖尿病大鼠和正常大鼠間的差異蛋白，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 40只SPF級雌性Wistar大鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，體質(zhì)量180～220 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（閩）2009-0001，單籠 5只飼養(yǎng)，自由取食和飲水，12 h光照／12 h黑暗，室溫25℃，相對濕度80%?；A(chǔ)飼料配方由動物實驗中心提供，高脂飼料配方參照本課題組前期實驗的高脂飼料配方［7］。

1.2 實驗藥物 石斛合劑1號方（石斛15 g，黃芪20 g，五味子 8 g，葛根 15 g，生地黃 15 g，丹參 15 g，知母 12 g等）、石斛合劑 2號方（茵陳 18 g，滑石15 g，扁蓄 15 g，梔子 10 g，大黃 6 g等）購自福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂。上述2方分別經(jīng)浸泡、水煎、水浴鍋蒸發(fā)濃縮至流浸膏，用乙醇提取，濾過，回收乙醇，加水制備成含生藥量2 g／mL的濾液，每瓶100 mL分裝滅菌。二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）用蒸餾水稀釋至含藥量5 g／L，每瓶100 mL分裝。

1.3 實驗試劑與儀器 鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；iTRAQ試劑（美國SCIEX公司）；質(zhì)譜級胰蛋白酶（美國 Promega公司）；Multifuge X1R型低溫高速離心機（美國Thermo公司），Triple TOF 5600 質(zhì)譜儀器（AB SCIEX，Concord，ON 美國SCIEX公司）；LC-20AD納升液相色譜儀（日本島津公司）。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備 以隨機數(shù)表法分為正常組10只和造模組30只。正常組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂高糖飼料，均喂養(yǎng)6周。對造模組大鼠2次腹腔注射STZ（體質(zhì)量＜200 g的大鼠按25 mg／kg注射，體質(zhì)量＞200 g的大鼠聯(lián)合體表面積注射，間隔3 d）。5 d后，尾靜脈取血測血糖，選取連續(xù)2天FBG＞7.0 mmol／L或 PBG＞16.7 mmol／L者為糖尿病模型大鼠，本次造模大鼠全部成模。

2.2 分組和干預(yù) 取成模大鼠30只，采用隨機數(shù)表法分為模型組、石斛合劑組、二甲雙胍組各10只。石斛合劑組先以石斛合劑1號方按17.2 g／（kg·d）灌胃 7 d，繼以石斛合劑 2 號方按 12.4 g／（kg·d）灌胃3 d，如此循環(huán)灌胃；二甲雙胍組以二甲雙胍按100 mg／（kg·d） 灌胃；模型組、正常組用等量生理鹽水灌胃，每日上午9時灌胃，持續(xù)60 d。

2.3 動物取材 于末次用藥24 h后進行動物取材，稱量大鼠體質(zhì)量后以10%烏拉坦麻醉，迅速開腹，取肝組織置于液氮中儲存以行蛋白組學檢測。每組取3只大鼠，剩余大鼠用于課題組其他實驗。

2.4 iTRAQ檢測肝組織蛋白質(zhì)組學

2.4.1 蛋白質(zhì)提取和濃度定量 用蛋白裂解液溶解肝臟蛋白質(zhì)樣品，繼而還原打開二硫鍵，以便充分酶解蛋白。采用Bradford法對蛋白進行濃度定量，并依據(jù)標準曲線計算出樣品濃度。

2.4.2 蛋白質(zhì)酶解和iTRAQ標記 每個樣品取100 μg蛋白置于離心管中酶解，并按照iTRAQ試劑盒說明書進行標記；等量、充分混勻標記后的樣品，離心后備用。

2.4.3 強陽離子交換色譜（SCX）預(yù)分離 將標記好的混合肽段復溶后進行梯度洗脫；并根據(jù)峰型和時間收取梯度組分，除鹽后凍干。繼而行蛋白質(zhì)液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-ESI-MS／MS）分析。最后進行納升液相色譜儀分離（每個組分上樣 5 μL）后采集數(shù)據(jù)。

2.5 生物信息分析 本次使用數(shù)據(jù)庫為IPI（International Protein Index）Rat（39925 sequences）， 并 使用蛋白質(zhì)鑒定軟件Mascot 2.3.02軟件進行分析。通過生物信息學分析工具DAVID在線分析對鑒定的蛋白進行GO（Gene Ontology）功能注釋、定位分析及功能富集分析。當?shù)鞍棕S度比的差異倍數(shù)達到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗P＜0.05時，視為差異蛋白。檢索參數(shù)設(shè)置見表1。

3 結(jié) 果

3.1 質(zhì)譜基本鑒定信息和質(zhì)量評估 通過Mascot軟件進行分析，得到總的二級譜圖數(shù)：347 098張，匹配到的譜圖數(shù)量60 622張，共鑒定出iTRAQ標記定量信息的肽段15 272個，特有肽段14 342個，蛋白3 631個。我們從圖1中看到，在全掃描范圍內(nèi)絕大部分的離子delta值（即偏差）顯示以0為中心的正態(tài)分布，都集中于±10 ppm之間。

圖1 肽段的質(zhì)量準確度分布圖

3.2 GO注釋 GO功能注釋具有三級結(jié)構(gòu)的標準定義，包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和蛋白質(zhì)所屬的細胞組分（cellular component，CC）三個層次，蛋白質(zhì)所屬的細胞組分，即亞細胞定位。見圖2。

3.3 肝臟組織差異蛋白質(zhì)的篩選 本研究利用iTRAQ技術(shù)對各組大鼠肝臟進行蛋白組學分析，各組大鼠差異蛋白統(tǒng)計數(shù)量見表2，與糖尿病相關(guān)的差異蛋白見表3。

4 討 論

4.1 iTRAQ蛋白質(zhì)組學 蛋白質(zhì)組學的概念由澳大利亞科學家最先提出［15］，研究技術(shù)從雙向凝膠電泳技術(shù)逐漸發(fā)展至基于質(zhì)譜鑒定的多維液相色譜分離技術(shù)［16］。其中被廣泛應(yīng)用的 iTRAQ技術(shù)是2004年美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司推出的一種全新的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)［17］。該技術(shù)對低豐度蛋白檢測的靈敏度高，蛋白覆蓋率高，在iTRAQ標記過程中仍能保留常見的翻譯后修飾位點［18］。以iTRAQ為標記的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，是尋找差異表達蛋白和篩選與疾病相關(guān)的蛋白分子標志物的理想工具［19］。本研究共鑒定出iTRAQ標記定量信息的肽段15272個，蛋白3 631個。我們從離子的質(zhì)量偏差分布圖看出，所測得的肽段質(zhì)量數(shù)穩(wěn)定，偏差小，表明了儀器的準確度高，穩(wěn)定性好，對后續(xù)研究提供質(zhì)量保證。

圖2 GO功能注釋圖

表2 各組大鼠差異蛋白統(tǒng)計數(shù)量

4.2 GO注釋 針對鑒定出的差異蛋白進行GO功能注釋，包括蛋白質(zhì)所屬的細胞組分（CC）、生物過程（BP）和分子功能（MF）三個層次，從而確認蛋白質(zhì)在哪些分子功能或生物學過程顯著富集。結(jié)果顯示，在CC層次（圖2A），細胞（cell）所占百分比最高為19.17%，接著依次是細胞部分（cell part）、細胞器（organelle）、細胞膜（membrane）、大分子復合物（macromolecular complex）等，GO功能分析顯示，在細胞核、胞漿中表達的差異蛋白質(zhì)所占比重較突出。在BP 層次（圖 2B），細胞過程（cellular process）所占百分比最高為12.79%，接著依次是代謝過程（metabol-ic process）、單組織過程（single-organism process）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）等，揭示差異表達蛋白大多參與了細胞代謝過程、初級代謝過程、代謝合成、信號傳導等。在MF層次（圖2C），參與綁定（binding）功能的差異蛋白所占百分比最高為50.75%，接著依次是催化活性（catalytic activity）、酶調(diào)節(jié)活動（enzyme regulator activity）、結(jié)構(gòu)分子活動（structural molecule activity）、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活動（protein binding transcription factor activity）等，揭示這些蛋白參與酶的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄活性、水解代謝反應(yīng)等功能。

表3 與糖尿病相關(guān)的差異蛋白

4.3 肝臟組織差異蛋白質(zhì) 本研究采用iTRAQ為標記的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的新技術(shù)對各組大鼠肝臟進行檢測，結(jié)果顯示與正常組相比，模型組差異蛋白161種；與模型組相比，石斛合劑組總差異性蛋白數(shù)量為352種；二甲雙胍組總差異性蛋白數(shù)量為125種。雖然鑒定出的差異蛋白數(shù)量較多，但亦有部分未知功能的蛋白，這里僅討論與糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)的蛋白。

高血糖是導致鐵蛋白增高的主要因素［20］，流行病學研究提示高鐵蛋白水平和糖尿病的發(fā)生呈正相關(guān)［21］，是糖尿病的危險因素［22］。 本研究結(jié)果顯示模型組鐵蛋白輕鏈1較正常組升高，這與課題組前期糖尿病大鼠肝臟蛋白芯片的結(jié)果一致［23］，說明糖尿病大鼠鐵代謝異常。而模型組下調(diào)的ApoE是一種主要由肝臟產(chǎn)生的糖基化分泌蛋白，參與脂質(zhì)的運輸、儲存及排泄過程，抑制血小板積聚［24］，一旦其構(gòu)象或濃度發(fā)生了變化，將導致血脂代謝異常，進而引發(fā)糖尿病，因此 ApoE基因成為糖尿病的常見候選基因之一［25］。金屬硫蛋白（metallothionein，MT）所含的半胱氨酸能與金屬相結(jié)合，具有強大的自由基清除能力，其亞型MT-Ⅰ／Ⅱ主要分布在肝和腎。MT通過增加葡萄糖利用及能量供應(yīng)，抗氧化應(yīng)激，抑制細胞凋亡來減少糖尿病導致的心臟損傷和腎損傷［26］。本研究中結(jié)果顯示模型組中MT-Ⅰ／Ⅱ明顯下調(diào)，可能與糖尿病及其心、腎并發(fā)癥相關(guān)。

甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase，MVK）是體內(nèi)膽固醇代謝途徑的重要限速酶［27］，該途徑先以乙酰輔酶A為原料并在MVK的催化作用下最終生成膽固醇、法呢基焦磷酸等。本研究結(jié)果顯示乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、MVK、法呢基焦磷酸合酶在模型組中均出現(xiàn)了上調(diào)，提示甲羥戊酸途徑被激活，說明糖尿病大鼠肝臟的脂代謝活躍。

脂肪酸結(jié)合蛋白廣泛存在于機體多種組織內(nèi)，包括脂肪細胞型、表皮型、心肌型、肝臟型等，具有介導脂肪酸轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)膽固醇代謝的功能，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［28］，并參與胰島素信號轉(zhuǎn)導過程，其表達水平影響多種肝臟病變，被認為可成為肝損傷的監(jiān)測指標［29］。 Yeung 等［30］研究發(fā)現(xiàn)表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白與血肌酐、腎小球濾過率呈顯著相關(guān)，并有可能是預(yù)測糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素。本研究中模型組上調(diào)的表皮型和心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白除了影響糖尿病大鼠糖脂代謝以外，可能與糖尿病肝腎并發(fā)癥相關(guān)。

蛋白的泛素化修飾過程失調(diào)在癌癥、代謝綜合征等疾病中發(fā)揮重要作用。泛素化因子E4B能將泛素鏈信號由非降解型轉(zhuǎn)換為可降解型，以促進修飾底物的降解［31］。本研究結(jié)果顯示模型組E4B下調(diào)，推測糖尿病模型大鼠出現(xiàn)泛素化修飾過程異常。組蛋白H2A的泛素化修飾參與了DNA損傷修復［32］，對維持基因組的穩(wěn)定性有重要意義，本研究結(jié)果中模型組的組蛋白H2A相關(guān)基因（histone H2A.Z）表達降低，使其不能及時參與DNA損傷修復過程，可能與大鼠糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)。

原肌球蛋白是一種細肌絲相關(guān)蛋白，其表達量下降可以使細胞骨架重組，形態(tài)發(fā)生變化，參與纖維化和癌癥等疾病進程中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［33］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病模型大鼠原肌球蛋白α-1鏈異構(gòu)體H、原肌球蛋白α-4鏈在模型組均出現(xiàn)下調(diào)，推測可能與糖尿病肝纖維化進程中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。這些肝細胞骨架蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白的改變可導致肝臟細胞形態(tài)學的改變，繼而引起肝損傷甚至腫瘤。

這些模型組較正常組上調(diào)或下調(diào)的蛋白涉及細胞結(jié)構(gòu)、能量代謝-電子傳遞、翻譯的調(diào)控及翻譯后修飾、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、氨基酸代謝、脂肪酸氧化等方面，說明糖尿病模型大鼠存在著諸多代謝紊亂，這些差異蛋白直接或間接地影響糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。經(jīng)石斛合劑和二甲雙胍治療后，模型組上調(diào)和下調(diào)的部分蛋白出現(xiàn)一定程度的恢復，如石斛合劑治療后，乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、脂肪酸結(jié)合蛋白、等下調(diào)，而ApoE、原肌球蛋白 α-1鏈異構(gòu)體H等上調(diào)；二甲雙胍治療后乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、脂肪酸結(jié)合蛋白等下調(diào)，而金屬硫蛋白1、組蛋白、泛素化因子E4B等上調(diào)。由此可見經(jīng)石斛合劑組和二甲雙胍組治療后趨向恢復的蛋白種類存在不同，這表明中藥復方石斛合劑與西藥二甲雙胍對糖尿病大鼠的靶蛋白的影響不一樣。由于糖尿病發(fā)病機制復雜，病變累及全身多系統(tǒng)多器官，質(zhì)譜分析的數(shù)據(jù)復雜度高，后續(xù)研究將進一步結(jié)合信號通路進一步探討糖尿病的分子機制，為石斛合劑的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。