熒光定量聚合酶鏈式反應法與酶聯(lián)免疫吸附試驗法在乙型肝炎病毒檢測中的應用價值

謝玉娜

福建省龍巖市人民醫(yī)院檢驗科 （福建龍巖 36400）

乙型肝炎病毒 （HBV）是一種嗜肝DNA病毒，乙型病毒性肝炎是一種傳染性疾病，該病發(fā)病率極高，且傳播途徑復雜、感染率高、流行面廣等，長期攜帶HBV可造成肝臟炎性損傷，誘發(fā)肝衰竭、肝硬化等疾病，且可引起肝細胞癌［1-2］。我國乙型病毒性肝炎的患病人數(shù)位居世界首位，嚴重危害人們的健康。因此，尋找一種快速有效的檢測方式意義重大。熒光定量聚合酶鏈式反應 （FQ-PCR）法與酶聯(lián)免疫吸附試驗 （ELISA）法是臨床常用的兩種檢測方式。本研究旨在探討FQ-PCR法與ELISA法在HBV檢測中的應用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月至2018年6月我院接診的248例疑似HBV感染患者為研究對象，男151例，女97例；年齡21～75歲，平均 （38．64±8．57）歲。排除出血傾向、凝血功能障礙，以及精神類疾病等患者。

1.2 方法

（1）ELISA法。采集入選患者2 ml空腹靜脈血，進行10 min的3 500 r／min離心操作，取血清。使用Bio-Tek（ELX-808）酶標儀、PW-960Plus全自動酶標洗板機 （購自深圳匯松科技發(fā)展有限公司）和上?？迫A生物工程股份有限公司提供的試紙盒檢測乙型肝炎標志物，包括乙型肝炎表面抗體（HBsAb）、乙型肝炎表面抗原 （HBsAg）、乙型肝炎e抗體（HBeAb）、乙型肝炎核心抗體 （HBcAb）、乙型肝炎 e抗原（HBeAg）。嚴格按照試紙盒說明書上步驟進行操作。經（A450～630 nm）計算吸光度值，或用酶標儀讀取450 nm位置吸光度值，經吸光度值判定檢測結果。（2）FQ-PCR法。采集入選患者2 ml空腹靜脈血，放置在真空惰性分離膠促凝管內，進行10 min的3 500 r／min離心操作，以制備血漿標本，使用購自美國ABI公司7500型FQ-PCR儀、艾康生物技術 （杭州）有限公司提供的HBV核酸定量檢測試劑盒檢測HBV-DNA濃度。

1.3 臨床評價

記錄乙型肝炎核酸定量DNA的陽性率與HBsAb、HBsAg、HBeAb、HBcAb、HBeAg的陽性率。將ELISA法檢測5項乙型肝炎標志物結果分為HBeAb、HBsAg、HBcAb陽性等 “小三陽”組與HBeAg、HBsAg、HBcAb陽性等 “大三陽”組，將兩者的陽性率和乙型肝炎核酸定量DNA結果進行比較。判斷標準：（1）FQ-PCR法，HBV-DNA濃度＜500 copies／ml為陰性，濃度≥500 copies／ml為陽性；（2）ELISA法，檢測樣本吸光度值臨界值為1，當測定值＞1時結果評定為陽性，＜1時判定為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS21．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FQ-PCR法與ELISA法檢測陽性率

FQ-PCR法與ELISA法檢測HBV-DNA、HBsAb、HB-sAg、HBeAb、HBcAb、HBeAg陽 性 率 分 別 為 60．48%、43．95%、36．29%、15．32%、33．47%、6．45%。見表 1。

表1 FQ-PCR法與ELISA法檢測陽性率 ［例 （%）］

2.2 HBV-DNA組與大、小三陽組檢測陽性率比較

HBV-DNA組檢測陽性率高于大、小三陽組，差異有統(tǒng)計學意義 （χ2=162．581、107．451，P=0．000、0．000）。見表2。

表2 HBV-DNA組與大、小三陽組檢測陽性率比較 ［例 （%）］

3 討論

乙型肝炎屬于病毒性肝炎，有較強的傳染性，HBV為主要病毒。我國攜帶HBV人數(shù)高達9 300萬人，其長期潛伏于機體內，部分HBV攜帶者會因機體內HBV被激活而患乙型肝炎。乙型肝炎存在起病緩慢、病情遷延不愈、傳染率高、傳播途徑廣等特點，且大部分患者的臨床癥狀不明顯，就診時已發(fā)展為晚期，患者需持續(xù)治療，使其身體痛苦與經濟上的負擔大幅度上升。早期、高效的確診，實施正確、有效的治療，可防止病情進一步惡化，是提高患者生存率的關鍵。由于臨床上大量使用抗病毒藥物，大幅度增加了HBV變異株數(shù)量，增加了傳統(tǒng)的HBV血清學檢測難度，檢測的敏感性、準確性和可重復性均存在缺陷。ELISA法為傳統(tǒng)的檢測HBV感染手段，可有效檢測血清中特異性抗體和抗原，對患者是否感染HBV進行判斷，且操作簡單［3-4］。其檢測結果受到多種因素的影響，如血清分離，標本保存；加樣是否存在濺出、氣泡；加樣加在孔壁非包被區(qū)；洗板情況；孵育方式與時間等。ELISA法檢測需要特殊設備、反應時間長，且難以定量分析病毒的量與感染程度，不適用于無償獻血及門診、急診初篩工作。FQ-PCR法融合了DNA探針雜交與PCR兩種技術，可經閉管檢測與熒光技術直接探測到熒光信號在PCR過程中的變化，定量、定性分析HBV感染患者的感染程度［5］。

HBeAg是判斷血清是否存在傳染性的主要指標，而HB-sAg是診斷健康攜帶者與急性乙型肝炎患者的主要指標。HBeAg、HBsAg、HBcAb三者陽性 （大三陽）表示患者機體內HBV-DNA傳染性強、復制率高［6］。本研究結果顯示，HBV-DNA組檢測陽性率高于大、小三陽組，提示FQ-PCR法檢測價值高于ELISA法，可較好地判斷患者是否處于HBV感染期。FQ-PCR法是以每毫升的拷貝數(shù)定量地發(fā)出檢測報告，可準確、真實、可靠、定量地反映HBV-DNA濃度。FQ-PCR法可經分子水平對HBV-DNA濃度進行直接檢測，可直觀體現(xiàn)HBV活動性、存活與復制水平以及傳染性［7］。本研究小三陽組的陽性率較低，提示該組存在少量傳染性不強、復制較弱的HBV，可能與基本核心及前C區(qū)啟動子區(qū)變異而形成終止密碼子有關，因其處于感染潛伏狀態(tài)，需積極監(jiān)測病情，并及時實施抗病毒治療。大三陽組的陽性率最低，提示大量存在傳染性強、高度復制的HBV，臨床需及時確診，并對患者實施足量、長期的抗病毒治療。FQ-PCR法檢測HBV-DNA也存在一定的不足，如無法反映機體經病原體入侵后，抗體如何做應答及其結果；無法檢測出病原體的數(shù)量等，難以取代血清學標志物的地位，但因其具有檢測結果可靠、高敏感度等優(yōu)點，可真實反映病毒DNA復制情況和HBV感染狀態(tài)，可為判斷乙型肝炎傳染性、早期診斷、治療監(jiān)測，以及評估病情轉歸提供參考依據(jù)，必要時可使用ELISA法與FQ-PCR法聯(lián)合檢測，進一步提升診斷準確性，進而提高治療有效性，改善患者預后。

綜上所述，與ELISA法相比，F(xiàn)Q-PCR法可直觀反映肝細胞內HBV復制情況。